РНК-и дуқабата (dsRNA) КИТ ELISA

Ин маҷмӯа як пайвастшавӣ бо системаи биотин-Стрептавидин барои ченкунии миқдории dsRNA бо дарозии зиёда аз 60 ҷуфти асос (bp), новобаста аз пайдарпаӣ, як санҷиши иммуносорбенти ферментӣ (ELISA) мебошад.Пластинка бо антиденои зидди dsRNA пешакӣ пӯшонида шудааст.dsRNA, ки дар намуна мавҷуд аст, илова карда мешавад ва ба антителоҳое, ки дар чоҳҳо пӯшида шудаанд, мепайвандад.Ва он гоҳ антиденаи биотинии анти-dsRNA илова карда мешавад ва дар намуна ба dsRNA мепайвандад.Пас аз шустан, HRP-Streptavidin илова карда мешавад ва ба антителоҳои биотинилшудаи анти-dsRNA пайваст мешавад.Пас аз инкубатсия HRP-стрептавидин бастанашуда шуста мешавад.Сипас маҳлули субстрати TMB аз ҷониби HRP илова карда мешавад ва катализ карда мешавад, то маҳсулоти ранги кабудро тавлид кунад, ки пас аз илова кардани маҳлули турушии кислота ба зард табдил ёфт.Зичии зард ба миқдори мақсадноки dsRNA, ки дар табақ гирифта шудааст, мутаносиб аст.Абсорбенс дар 450 нм чен карда мешавад.

Ариза

Ин маҷмӯа барои ченкунии миқдории dsRNA боқимонда аст.

Компонентҳои комплект

Нигоҳдорӣ ва устуворӣ

1. Барои маҷмӯаи истифоданашуда: Тамоми маҷмӯаро метавон дар 2~8℃ дар мӯҳлати истифода нигоҳ дошт.Барои устувории нигоҳдорӣ аз нури қавӣ бояд канорагирӣ кард.

2. Барои маҷмӯаи истифодашуда: Пас аз кушода шудани микроплата, лутфан чоҳҳои истифоданашударо бо мӯҳркунандаи табақ пӯшонед ва ба халтаи фолгаи дорои бастаи хушккунанда баргардед, халтаи фолгаро бо печондан печонед ва пас аз истифода ҳарчи зудтар ба 2~8℃ баргардед.Дигар реактивҳо бояд ҳарчи зудтар пас аз истифода ба 2~8℃ баргардонида шаванд.

Маводҳои зарурӣ, вале таъмин нестанд

1. Хонандаи микроплата бо филтри 450±10 нм (беҳтар аст, агар дар дарозии мавҷҳои 450 ва 650 нм муайян карда шавад).

2. Шакари микроплата.

3. Маслиҳатҳои RNase озод ва найҳои центрифуга.

Схемаи амалиёт

Пеш аз он ки шумо оғоз кунед

1. Пеш аз истифода ҳама ҷузъҳои маҷмӯа ва намунаҳоро ба ҳарорати хонагӣ (18-25℃) оваред.Агар маҷмӯа дар як вақт истифода нашавад, лутфан танҳо тасмаҳо ва реактивҳоро барои озмоиши ҳозира гиред ва тасмаҳо ва реактивҳои боқимондаро дар ҳолати зарурӣ гузоред.

2. Буфери шустушӯй: 40 мл буфери шустани 20 × консентратӣ бо 760 мл оби деионизатсияшуда ё дистиллшуда барои тайёр кардани 800 мл буфери шустани 1 × маҳлул кунед.

3. Стандарт: пеш аз истифода маҳлулро ба таври мухтасар чарх занед ё центрифуга кунед.Консентратсияи чор стандарти пешниҳодшуда 5ng/μL аст.Барои стандартҳои UTP ва pUTP dsRNA, лутфан маҳлули саҳомиро то 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL бо буфери STE барои кашидани каҷи стандартӣ об кунед.Барои стандартҳои N1-Me-pUTP dsRNA, лутфан маҳлули саҳроиро ба 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL бо буфери STE барои кашидани каҷи стандартӣ об кунед.Барои стандарти 5-OMe-UTP dsRNA, лутфан маҳлули захираро ба 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL бо буфери STE барои кашидани каҷи стандартӣ об кунед.Мо тавсия медиҳем, ки стандартҳоро ҳамчун диаграммаҳои зерин ҳал кардан мумкин аст:

4. Антиденои муайянкунандаи биотинилшуда ва маҳлули кории HRP-стрептавидин: пеш аз истифода маҳлулро ба таври мухтасар чарх занед ё центрифуга кунед.Онҳоро то консентратсияи корӣ бо буфери ҳалкунанда об кунед.

5. Зер ҳолати TMB: миқдори зарурии маҳлулро бо нӯгҳои стерилизатсияшуда ҷӯшонед ва маҳлули боқимондаро дубора ба шиша напартоед.Зерзаминаи TMB ба рӯшноӣ ҳассос аст, ба субстрати TMB муддати дароз ба рӯшноӣ дучор нашавед.

Истифодаи протокол

1. Миқдори тасмаҳои заруриро барои таҳлил муайян кунед.Барои истифода тасмаҳоро дар чаҳорчӯба гузоред.Тасмаҳои боқимондаи табақе, ки дар ин таҳлил истифода нашудаанд, бояд дар халта бо хушккунанда аз нав печонида шаванд.Халтаро барои нигоҳдории яхдон сахт пӯшед.

2. Ҳар як маҳлули стандартӣ, холӣ ва намунаҳоро ба чоҳҳои мувофиқ 100 мкл илова кунед.Бо мӯҳркунандаи табақ пӯшонед.Барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ бо ларзиш дар 500 rpm инкубатсия кунед.Намунаҳо бояд бо буфери STE то консентратсияи мувофиқ барои ташхиси дақиқ ҳал карда шаванд.

3. Қадами шустан: Маҳлулро аспират кунед ва бо буфери шустани 250 мкл ба ҳар як чоҳ бишӯед ва бигзор он барои 30 сония истода бошад.Буфери шустушӯйро бо гузоштани табақ ба коғази абсорбент пурра партоед.Ҳамагӣ 4 маротиба шустан.

4. Ба ҳар як чоҳ 100 мкл маҳлули кории антителоҳои биотинӣшударо илова кунед.Бо мӯҳркунандаи табақ пӯшонед.Барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ бо ларзиш дар 500 rpm инкубатсия кунед.

5. Қадами шустанро такрор кунед.

6. Ба ҳар як чоҳ 100 мкл маҳлули кории HRP-стрептавидин илова кунед.Бо мӯҳркунандаи табақ пӯшонед.Барои 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ бо ларзиш дар 500 rpm инкубатсия кунед.

7. Қадами шустанро боз такрор кунед.

8. Ба ҳар як чоҳ 100 мкл маҳлули субстрати TMB илова кунед.Бо мӯҳркунандаи табақ пӯшонед.Дар давоми 30 дақиқа дар RT инкубатсия кунед Аз рӯшноӣ муҳофизат кунед.Моеъ бо илова кардани маҳлули субстрат кабуд мешавад.

9. Ба ҳар як чоҳ 50 мкл маҳлули қатъкунанда илова кунед.Моеъ бо илова кардани маҳлули қатъӣ зард мешавад.Сипас хонандаи микроплатаро иҷро кунед ва фавран дар 450 нм андозагирӣ кунед.

Ҳисобкунии натиҷаҳо

1. Миёнаи хонишҳои такрориро барои ҳар як стандарт, назорат ва намунаҳо ҳисоб кунед ва зичии миёнаи оптикии сифрро хориҷ кунед.Каҷи стандартиро бо абсорбсия дар меҳвари амудӣ (Y) ва консентратсияи dsRNA дар меҳвари уфуқӣ (X）) созед.

2. Тавсия дода мешавад, ки ҳисобкуниро бо нармафзори компютерии мувофиқи каҷ ба мисли мутахассиси curve 1.3 ё ELISA Calc дар модели мувофиқи 5 ё 4 параметри ғайрихаттӣ иҷро кунед.

Намоиш

1. Ҳассосият:

маҳдудияти поёнии ошкор: ≤ 0.001pg/μL (барои UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (барои 5-OMe-UTP-dsRNA).

маҳдудияти поёнии миқдор: 0,0156 pg/μL (барои UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (барои N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/mkL (барои 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Дақиқӣ: резюмеи дохилии таҳлил ≤10%, CV аз таҳлили байнитаҳлил ≤10%

3. Барқароршавӣ: 80% ~ 120%

4.Хатӣ: 0.0156-0.5pg/μL (forUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (барои 5-OMe-UTP-dsRNA).

Мулоҳизаҳо

1. Ҳарорати реаксияи TMB ва вақти муҳим аст, лутфан онҳоро мувофиқи дастур ба таври қатъӣ назорат кунед.

2. Барои ноил шудан ба такрорпазирӣ ва ҳассосияти хуби таҳлил, шустани дурусти плитаҳо барои хориҷ кардани реагентҳои зиёдатии реаксиянашаванда муҳим аст.

3. Ҳамаи реактивҳо бояд пеш аз истифода бодиққат омехта карда шаванд ва ҳангоми илова кардани намуна ё реагентҳо аз ғафсҳо пешгирӣ карда шаванд.

4. Агар дар буфери шустани консентратӣ (20х) кристаллҳо пайдо шуда бошанд, то 37℃ гарм кунед ва то он даме, ки кристаллҳо пурра об шаванд, мулоим омехта кунед.

5. Аз таҳлили намунаҳое, ки дорои азиди натрий (NaN3) доранд, худдорӣ намоед, зеро он метавонад фаъолияти HRP-ро нобуд созад, ки боиси кам баҳодиҳии миқдори dsRNA мегардад.

6. Ҳангоми таҳлил аз ифлосшавии RNase худдорӣ намоед.

7. Стандарт/намуна, антитело детекторӣ ва SA-HRP низ метавонад дар RT бидуни ларзиш гузаронида шавад, аммо ин метавонад боиси як маротиба кам шудани ҳассосияти ошкор гардад.Барои ин, мо тавсия медиҳем, ки стандартҳои UTP ва pUTP dsRNA бояд аз 2pg/μL, стандартҳои N1-Me-pUTP dsRNA аз 4pg/μL ва стандарти 5-OMe-UTP dsRNA аз 8pg/μL ҳал карда шаванд.Илова бар ин, маҳлули кории HRP-стрептавидинро барои 60 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкуб кунед.Колбаро шакку истифода набаред, зеро колба метавонад ба натиҷаи нодуруст оварда расонад.

Натиҷаи маъмулӣ

1. Маълумоти стандартии каҷ

2. Ҳисобкунии каҷи стандартӣ

3. Диапазони муайянкунии Liner: 0,0312- 1pg/μL