M-MLV транскриптазаи баръакс
Транскриптазаи баръакси RevScript бо технологияи муҳандисии генетикӣ ба даст оварда мешавад.Он дорои қобилияти баландтари синтези cDNA, устувории гармӣ ва маҳдудияти ҳарорати реаксия (то 60 ° C).Маҳсулоти cDNA-и синтезшуда то 10 кб аст.Он наздикии қолибҳоро афзоиш медиҳад ва барои транскрипсияи баръакси қолибҳои РНК бо сохтори мураккаби дуюмдараҷа ё генҳои нусхабардории кам мувофиқ аст.
Компонентхо
| Компонент | HC2003В (10,000U) | HC2003В (5*10,000U) | HC2003В (200,000U) |
| Транскриптазаи баръакси RevScript (200U/μL) | 50 мкл | 5×50 мкл | 1 мл |
| 5 × буфери RevScript | 250 мкл | 1,25 мл | 5 мл |
Ҳолати нигоҳдорӣ
Ин маҳсулот бояд дар -25 ° C ~ - 15 ° C барои 2 сол нигоҳ дошта шавад.
Таърифи воҳид
Як воҳид 1 нмол dTTP-ро ба маводи дар кислота ҳалнашаванда дар 10 дақиқа дар 37 ° C бо истифода аз Oligo(dT) ҳамчун праймер дохил мекунад.
Танзимоти реаксия
1.Денатуратсияи қолаби РНК (Ин қадам ихтиёрӣ аст, денатуратсияи қолаби РНК барои кушодани сохторҳои дуюмдараҷа кӯмак мекунад, ки ҳосили риштаи якуми cDNA-ро беҳтар мекунад.)
| Компонентхо | Ҳаҷм (мкЛ) |
| RNase озод ddH2O | Ба 13 |
| Олиго(дТ)18 (50 мкмоль/л) ё Primer тасодуфӣ (50 мкмоль/л) Ё праймерҳои мушаххаси ген (2 мкмоль/л) | 1 |
| ё 1 | |
| ё 1 | |
| Шаблон RNA | X a |
Эзоҳҳо:
1) а: умумии РНК: 1-5 ug ё mRNA: 1-500 нг
2) Дар ҳарорати 65°С барои 5 дақиқа инкубатсия кунед, сипас фавран ба ях гузаронед, то 2 дақиқа хунук кунед.Барои ҷамъ кардани моеъи реаксия центрифугаи кӯтоҳ, маҳлули реаксияи транскрипсияи баръаксро тавре ки дар ҷадвали зерин нишон дода шудааст, илова кунед.Бо нарм пипетка барои омехта кардан.
1.Омода кардани омехтаи реаксия (ҳаҷми 20 мкл)
| Компонентхо | Ҳаҷм (мкЛ) |
| Омезиши қадами қаблӣ | 13 |
| 5 × буфер | 4 |
| Mix dNTP (10нмол/л) | 1 |
| Транскриптазаи баръакс (200 U/μL) | 1 |
| Ингибитори RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Реаксияро дар шароити зерин иҷро кунед:
| Ҳарорат (°C) | Вақт |
| 25 °Ca | 5 дақиқа |
| 42 °Cb | 15-30 дақиқа |
| 85 °Cc | 5 дақиқа |
Эзоҳҳо:
1) а.Инкубатсия дар ҳарорати 25°C барои 5 дақиқа танҳо барои истифодаи гексамерҳои тасодуфӣ лозим аст.Лутфан ин қадамро ҳангоми истифодаи Oligo (dT) гузаред18ё Примери мушаххаси ген.
2) б.Ҳарорати тавсияшудаи транскрипсияи баръакс 42°C аст, Барои қолабҳои дорои сохторҳои мураккаби дуюмдараҷа ё миқдори баланди GC тавсия дода мешавад, ки ҳарорати реаксияро то 50-55°C баланд кунед.
3) в.Дар 85 ° C барои 5 дақиқа гарм кунед, то транскриптазаи баръаксро ғайрифаъол кунед.
4) Маҳсулотро бевосита дар реаксияҳои PCR ё qPCR истифода бурдан мумкин аст ё дар -20°C барои нигоҳдории кӯтоҳмуддат нигоҳ дошта мешавад.Тавсия дода мешавад, ки маҳсулотро ҷудо кунед ва дар ҳарорати -80 ° C барои нигоҳдории дарозмуддат нигоҳ доред.Аз яхобшавии зуд-зуд худдорӣ кунед.
5) Маҳсулот барои як қадами RT-qPCR мувофиқ аст, тавсия дода мешавад, ки ба ҳар як системаи реаксияи 25μL 10-20 U транскриптазаи баръакс илова кунед ё мувофиқи вазъияти воқеӣ миқдори транскриптазаи баръаксро тадриҷан зиёд кунед.
Қайдҳо
1.Лутфан майдони таҷрибавиро тоза нигоҳ доред;Ҳангоми кор бояд дастпӯшакҳои тоза ва ниқоб пӯшида шаванд.Ҳама масолеҳи дар таҷриба истифодашаванда бояд RNase озод бошанд, то ифлосшавии RNase пешгирӣ карда шаванд.
2.Барои пешгирӣ кардани таназзули РНК, ҳама расмҳо бояд дар ях анҷом дода шаванд.
3.Барои таъмини самаранокии баланди транскрипсияи баръакс, намунаҳои RNA-и баландсифат тавсия карда мешаванд.
4.Ин маҳсулот танҳо барои истифодаи тадқиқот аст.
5.Лутфан барои бехатарии худ бо куртаҳои лабораторӣ ва дастпӯшакҳои якдафъаина амал кунед.
