mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase аз штамми рекомбинатии E. coli гирифта шудааст, ки ген барои vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase дорад.Ин фермент як гурӯҳи метилро дар мавқеи 2´-O-и нуклеотиди аввал ба сохтори сарпӯш дар 5'-охири РНК илова мекунад. Фермент S-аденозилметионинро (SAM) ҳамчун донори метил барои метил кардани РНК-и сарпӯш (кап) истифода мебарад. -0) дар натичаи cap- 1 сохт.

Сохтори Cap1 метавонад самаранокии тарҷумаро афзоиш дода, ифодаи mRNA-ро дар таҷрибаҳои трансфексия ва микроинъекция беҳтар кунад. Ин фермент махсусан РНК-ро бо сарпӯши m7GpppN ҳамчун субстрат талаб мекунад.Он наметавонад РНК-ро бо pN, ppN, pppN ё GpppN дар охири 5' истифода барад.РНК-и пӯшида метавонад тавассути транскрипсияи in vitro бо истифода аз аналогии сарпӯш ё тавассути пӯшонидани ферментативӣ бо истифода аз Enzyme Vaccinia Capping омода карда шавад.

Компонентхо

Сарпӯши mRNA 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × буфери реаксияи сарпӯш

Нигоҳдорӣ

-25 ～- 15 ℃ барои нигоҳдорӣ （ Аз давраҳои такрории яхкунӣ ва обшавӣ худдорӣ кунед）

Буфери нигаҳдорӣ

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X- 100， 50% glycerol.

Таърифи воҳид

Як воҳид ҳамчун миқдори ферменте муайян карда мешавад, ки барои метилизатсияи 10 pmol транскрипти РНК-и сарпӯши 80 nt дар 1 соат дар ҳарорати 37 ° C лозим аст.

Санҷишҳои назорати сифат

Экзонуклеаза:50U аз mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase бо 1μg λ-Hind III ҳазм ДНК дар 37 ℃ дар давоми 16 соат, ҳеҷ таназзулеро, ки бо электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.

Эндонуклеаза: 50 U аз mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase бо 1 мкг λDNA дар 37℃ барои 16 соат, ҳеҷ таназзулеро, ки бо электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, медиҳад.

Никас: 50U аз mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase бо 1μg pBR322 дар 37 ℃ барои 16 соат ҳеҷ таназзулеро, ки бо электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.

RNase: 50U аз mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase бо 1,6μg MS2 RNA дар давоми 4 соат дар 37℃ ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.

E. coli ДНК: 50U аз mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase барои мавҷудиятиE. coli ДНК-и геномӣ бо истифода аз TaqMan qPCR бо праймерҳои махсус бароиE. coli Ҷойгиршавии 16S rRNA.ДарE. coli ифлосшавии геномии ДНК =1 астE. coli геном.

Бактериявӣ Эндотоксин: Санҷиши LAL, мувофиқи нашри Фармакопеяи IV Чин 2020, усули санҷиши лимити гел, қоидаи умумӣ (1143).Миқдори эндотоксинҳои бактериявӣ бояд =10 ЕС/мг бошад.

Система ва шароитҳои реаксия

1. Миқдори мувофиқи РНК-и сарпӯш ва RNase H2O-ро дар як найчаи микрофугаи 1,5 мл то ҳаҷми ниҳоии 16,0 мкЛ якҷоя кунед.

2. Дар 65 ℃ барои 5 дақиқа гарм кунед ва пас аз он ванна яхбандӣ барои 5 дақиқа.

3. Компонентҳои зеринро бо тартиби муқарраршуда илова кунед (барои метилизатсияи РНК-и сарпӯш

камтар аз 10

*10× Буфери реаксияи сарпӯш: 500 мм Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Дар ҳарорати 37℃ барои 1 соат инкубатсия кунед (барои порчаи мақсаднок камтар аз 200 нт 2 соат инкубатсия тавсия мешавад).

Барномаҳо

Барои беҳтар кардани ифодаи mRNA ҳангоми таҷрибаҳои микроинъекция ва трансфексия.

Эзоҳҳо дар бораи истифода

1. Пеш аз реаксия, РНК бояд тоза карда шавад ва дар оби бенуклеаз гудохта шавад, ҳама маҳлулҳо набояд ягон EDTA ва ион дошта бошанд.

2. Тавсия дода мешавад, ки РНК-и намунаро дар 65 ℃ барои 5 дақиқа пеш аз реаксия гарм кунед, то сохтори дуюмдараҷа дар 5´ охири транскрипт хориҷ карда шавад.Онро барои сохтори мураккаби 5´-терминалӣ то 10 дақиқа дароз кардан мумкин аст.