PNGase F
Пептид-N-Гликозидаза F (PNGase F) усули аз ҳама самараноки ферментативӣ барои хориҷ кардани қариб ҳама олигосахаридҳои ба N алоқаманд аз гликопротеинҳо мебошад.PNGase F як амидаза аст, ки байни боқимондаҳои GlcNAc ва аспарагини боқимондаи манноза, гибрид ва олигосахаридҳои мураккаб аз гликопротеинҳои ба N пайвастшуда ҷудо мешавад.
Ариза
Ин фермент барои хориҷ кардани пасмондаҳои карбогидрат аз сафедаҳо муфид аст.
Тайёрӣ ва мушаххасот
| Намуди зоҳирӣ | Моеъи бе ранг |
| тозагии сафеда | ≥95% (аз SDS-PAGE) |
| Фаъолият | ≥500,000 U/мл |
| Экзогликозидаза | Ягон фаъолият ошкор карда нашуд (ND) |
| Эндогликозидаза F1 | ND |
| Эндогликозидаза F2 | ND |
| Эндогликозидаза F3 | ND |
| Эндогликозидаза H | ND |
| Протеаз | ND |
Хосиятҳо
| рақами EC | 3.5.1.52(Рекомбинант аз микроорганизм) |
| Вазни молекулавӣ | 35 кДа (SDS-PAGE) |
| Нуқтаи изоэлектрикӣ | 8. 14 |
| рН оптималӣ | 7,0-8,0 |
| Ҳарорати оптималӣ | 65 °C |
| Хусусияти субстрат | Кандани пайвандҳои гликозидӣ байни GlcNAc ва пасмондаҳои аспарагин Расми 1 |
| Сайтҳои эътироф | Гликанҳои ба N алоқаманд, агар дар таркибаш α1-3 фукоза надошта бошанд, расми 2 |
| Фаъолкунандаҳо | ДТТ |
| Ингибитор | SDS |
| Ҳарорати нигоҳдорӣ | -25 ~-15 ℃ |
| Инактиватсияи гармӣ | Омехтаи реаксияи 20µL, ки дорои 1μL PNGase F мебошад, бо инкубатсия дар 75 °C барои 10 дақиқа ғайрифаъол карда мешавад. |
Расми 1 Хусусияти субстрати PNGase F
Расми 2 Шиносоии PNGase F.
Вақте ки пасмондаҳои дохилии GlcNAc ба α1-3 фукоза пайваст мешаванд, PNGase F олигосахаридҳои бо N-пайвасташударо аз гликопротеинҳо ҷудо карда наметавонад.Ин тағирот дар растаниҳо ва баъзе гликопротеинҳои ҳашарот маъмул аст.
Cмухолифон
|
| Компонентхо | Консентратсияи |
| 1 | PNGase F | 50 мкл |
| 2 | 10 × буфери денатуринги гликопротеин | 1000 мкл |
| 3 | 10 × Гликобуфер 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 мкл |
Таърифи воҳид
Як воҳид(U) ҳамчун миқдори ферменте, ки барои хориҷ кардани >95% карбогидрат аз 10 мкг RNase B-и денатуратшуда дар 1 соат дар 37°C дар ҳаҷми умумии реаксияи 10 мкл зарур аст, муайян карда мешавад.
Шароити реаксия
1. 1-20 мкг гликопротеинро бо оби деионизатсияшуда гудохта, 1 мкл 10 × гликопротеин буфери денатуринг ва H2O (агар лозим бошад) илова кунед, то ҳаҷми умумии реаксия 10 мкл ҳосил шавад.
2.Дар 100°С барои 10 дақиқа инкубатсия кунед, онро дар ях хунук кунед.
3.2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 илова кунед ва омехта кунед.
4.1-2 мкл PNGase F ва H илова кунед2O (агар лозим бошад) ҳаҷми умумии реаксияро 20 мкл созед ва омехта кунед.
5.Реаксияро дар 37°С барои 60 дақиқа инкуб кунед.
6.Барои таҳлили SDS-PAGE ё таҳлили HPLC.
