Ферментҳои пӯшонидани вируси Vaccinia

Ферментҳои бастабандии вируси Vaccinia аз штамми рекомбинатии E. coli гирифта шудааст, ки генҳои ферментҳои пӯшонидани Vaccinia-ро дорад.Ин як фермент аз ду зербахш (D1 ва D12) иборат аст ва дорои се фаъолияти ферментативӣ мебошад (трифосфатаза РНК ва гуанилиттрансфераза аз ҷониби зервоҳиди D1 ва гуанин метилтрансфераза аз ҷониби зервоҳиди D12).Enzyme capping virus Vaccinia барои катализ кардани ташаккули сохтори сарпӯш самаранок аст, ки метавонад сохтори сарпӯши 7-метилгуанилатро (m7Gppp, Cap 0) ба охири 5'-и РНК пайваст кунад.Сохтори сарпӯш (Cap 0) дар эътидоли mRNA, интиқол ва тарҷума дар эукариотҳо нақши муҳим дорад.Сарпӯши РНК бо реаксияи ферментативӣ як усули муассир ва соддаест, ки метавонад устуворӣ ва тарҷумаи РНК-ро барои транскрипсия, трансфекция ва микроинъекция дар vitro ба таври назаррас беҳтар созад.

Компонентхо

Ферментҳои бастани вируси Vaccinia (10 U/μL)

10 × буфери сарпӯш

Шароити нигоҳдорӣ

-25～- 15℃ барои нигоҳдорӣ （ Аз давраҳои такрории яхкунӣ ва обшавӣ худдорӣ кунед）

Буфери нигаҳдорӣ

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1мМ ДТТ, 0.1мМ ЭДТА, 0.1% Тритон X- 100, 50% глицерин.

Таърифи воҳид

Як воҳиди Enzyme Enzyme вируси Vaccinia ҳамчун миқдори ферменте муайян карда мешавад, ки барои ворид кардани 10pmol GTP ба транскрипти 80nt дар 1 соат дар ҳарорати 37°C зарур аст.

Назорати сифат

Экзонуклеаза:10U аз вируси Vaccinia Enzyme Capping Enzyme бо 1μg λ-Hind III ҳазми ДНК дар 37 ℃ барои 16 соат ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.

Эндонуклеаза:10U аз вируси Vaccinia Enzyme Capping Enzyme бо 1μg λDNA дар 37℃ дар тӯли 16 соат, ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.

Ника:10U ферменти бастани вируси Vaccinia бо 1 мкг pBR322 дар 37 ℃ дар тӯли 16 соат ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.

RNase:10U аз вируси Vaccinia Enzyme Capping Enzyme бо 1,6μg MS2 RNA дар давоми 4 соат дар 37℃ ҳеҷ таназзуле ба бор намеорад, тавре ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад.

1.ДНК coli:10U аз вируси Vaccinia Capping Enzyme барои мавҷудияти ДНК-и геномии E. coli бо истифода аз TaqMan qPCR бо праймерҳои мушаххас барои макони E. coli 16S rRNA тафтиш карда мешавад.Ифлосшавии ДНК-и геномии E. coli аст≤1 геноми E. coli.

2.Бактериявӣ Эндотоксин: Санҷиши LAL, мувофиқи нашри Фармакопеяи IV Чин 2020, усули санҷиши лимити гел, қоидаи умумӣ (1143).Миқдори эндотоксинҳои бактериявӣ бояд ≤10 EU/mg бошад.

Система ва шароитҳои реаксия

1. Протоколи сарпӯш (ҳаҷми реаксия: 20 мкл)

Ин тартиб ба реаксияи пӯшонидани РНК 10μg (≥100 nt) татбиқ мешавад ва онро мувофиқи талаботи таҷрибавӣ васеъ кардан мумкин аст.

I) 10 мкг РНК ва H2O-ро дар найчаи микрофугаи 1,5 мл то ҳаҷми ниҳоии 15,0 мкл якҷоя кунед.*10 × Буфери сарпӯш: 0,5М Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) Дар ҳарорати 65 ℃ барои 5 дақиқа гарм кунед ва пас аз ванна яхбандӣ барои 5 дақиқа.

3) Бо тартиби муқарраршуда ҷузъҳои зеринро илова кунед

*10 × Буфери сарпӯш: 0,5 М Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) Дар 37°C дар давоми 30 дақиқа инкубатсия кунед, РНК ҳоло баста шудааст ва барои барномаҳои поёноб омода аст.

2. 5′ терминал реаксияи тамғагузорӣ (ҳаҷми реаксия: 20 мкл)

Ин протокол барои нишон додани РНК дорои трифосфати 5' пешбинӣ шудааст ва онро мувофиқи талабот васеъ кардан мумкин аст.Самаранокии ворид кардани нишонаҳо аз таносуби молярии РНК: GTP ва инчунин мундариҷаи GTP дар намунаҳои РНК таъсир мерасонад.

1) Миқдори мувофиқи РНК ва H2O-ро аз нуклеазҳо дар як найчаи микрофугаи 1,5 мл то ҳаҷми ниҳоии 14,0 мкл омехта кунед.

2) Дар ҳарорати 65 ℃ барои 5 дақиқа гарм кунед ва пас аз ванна яхбандӣ барои 5 дақиқа.

3) Қисмҳои зеринро бо тартиби муқарраршуда илова кунед.

** GTP MIX ба GTP ва шумораи ками маркерҳо дахл дорад.Барои консентратсияи GTP, нигаредба ёддошт 3.

4) Дар 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия кунед, охири РНК 5' ҳоло нишонгузорӣ шудааст ва барои поёноб омода аст

Барномаҳо

1. Сарпӯши mRNA пеш аз таҳлилҳои тарҷума/тарҷумаи in vitro

2. Нишон додани 5´ охири mRNA

Эзоҳҳо дар бораи истифода

1.Гарм кардани маҳлули РНК пеш аз инкубатсия бо Vaccinia Capping Enzyme сохтори дуюмдараҷаро дар охири 5-уми транскрипт нест мекунад.Вақтро то 60 дақиқа барои стенограммаҳо бо 5'ноҳҳои хеле сохтории маълум дароз кунед.

2. РНК, ки барои бастани реаксияҳо истифода мешавад, бояд пеш аз истифода тоза карда шавад ва дар оби бидуни нуклеаз боздошта шавад.EDTA набояд мавҷуд бошад ва маҳлул бояд аз намакҳо холӣ бошад.

3. Барои тамғагузорӣ кардани охири 5´, консентратсияи умумии GTP бояд тақрибан 1-3 маротиба аз консентратсияи молярии mRNA дар реаксия бошад.

4. Ҳаҷми системаи реаксияро мувофиқи воқеият калон ё паст кардан мумкин аст.