5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Гурба №: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) омехтаи хеле устувори як найчаи зонд мебошад, ки барои транскрипсияи як қадами баръакс ва PCR-и миқдорӣ (qRT-PCR) мувофиқ аст.Он пеш аз омехта кардани праймерҳо ва зондҳоро дастгирӣ мекунад ва пас аз нигоҳдории дарозмуддат дар ҳарорати паст устувор мемонад.Намунаи санҷидашавандаро метавон мустақиман ҳангоми истифода бидуни кушодани қубур/пипетажи иловагӣ илова кард.Ин маҳсулот ҷузъҳоро таъмин мекунад, масалан, полимеразаи гарми ДНК, M-MLV, гликозилаза ба гармии урацил ДНК (TS-UNG), ингибитори RNase, MgCl2, dNTPs (бо dUTP ба ҷои dTTP), ва стабилизаторҳо.Бо транскриптазаи баръакс ва полимерази ДНК амплификацияи босуръати аз ҷиҳати генетикӣ тағирёфта имкон дорад, ки амплификацияи ПТР дар давоми 20-40 дақиқа анҷом дода шавад.Ин реагент буфери махсусро барои qPCR бо ферментҳои омехтаи ферменти амплификацияи зидди ингибиторӣ ва ферменти UNG истифода мебарад.Аз ин рӯ, он метавонад амплификацияи хуби генҳои мақсаднокро ба даст орад ва амплификацияи бардурӯғро, ки аз ифлосшавии боқимондаи PCR ва аэрозолҳо ба вуҷуд омадааст, пешгирӣ кунад.Ин реагент бо аксари асбобҳои флюоресцентии миқдории PCR аз истеҳсолкунандагон ба монанди Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ва Roche мувофиқ аст.
Компонент
1.25 × Neoscript Fast RTase / UNG Mix
2.5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Шароити нигоҳдорӣ
Ҳама ҷузъҳо бояд дар -20 ℃ барои нигоҳдории дарозмуддат ва 4 ℃ то 3 моҳ нигоҳ дошта шаванд.Лутфан, пас аз обшавӣ бодиққат омехта кунед ва пеш аз истифода центрифуга кунед.Аз яхобшавии зуд-зуд худдорӣ кунед.
Омодасозии системаи реаксияи qRT-PCR
| Компонентхо | 25мкЛСистема | 50мкЛСистема | Консентратсияи ниҳоӣ |
| 5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase / UNG Mix | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| 25 × Омехтаи Пример-Зондa | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Шаблон РНКb | – | – | – |
| ДД2O | То 25 мкл | То 50 мкл | – |
1) а. Консентратсияи ниҳоии праймер одатан 0.2μM аст.Барои натиҷаҳои беҳтар, консентратсияи праймерро дар доираи 0,2-1μM оптимизатсия кардан мумкин аст.Умуман, консентратсияи зондро дар доираи 0.1-0.3μM оптимизатсия кардан мумкин аст.
2) б. Ҳангоми истифодаи Процедураи зуд ПЗР, зиёд кардани консентратсияи праймерҳо ва зондҳо метавонад ба натиҷаҳои беҳтари амплификация оварда расонад ва таносуби онҳо бояд мувофиқан оптимизатсия карда шавад.
3) Намудҳои гуногуни намунаҳо дорои намудҳо ва мундариҷаи ингибитор ва шумораи нусхаи генҳои мақсаднок мебошанд.Ҳаҷми намуна бояд аз рӯи ҳолати воқеӣ баррасӣ карда шавад.Агар лозим бошад, намунаро бо оби нуклеазӣ ё буфери TE ҳал кунед.
Реаксия Cшароит
| Тартиби муқаррарии PCR | Тартиби зуди PCR | ||||||
| Тартиб | Ҳарорат. | Вақт | Сикл | Тартиб | Ҳарорат. | Вақт | Сикл |
| Транскрипсияи баръакс | 50℃ | 10-20 дақиқа | 1 | Транскрипсияи баръакс | 50℃ | 5 дақиқа | 1 |
| Полимераз Фаъолсозӣ | 95℃ | 1-5 дақиқа | 1 | Полимераз Фаъолсозӣ | 95℃ | 30с | 1 |
| Денатуратсия | 95℃ | 10-20с | 40-50 | Денатуратсия | 95℃ | 1-3с | 40-50 |
| Табобат ва Васеъ | 56-64℃ | 20-60-ум | Табобат ва Васеъ | 56-64℃ | 3-20с | ||
Назорати сифат
1.Муайянкунии функсия: ҳассосият, хосият ва такроршавандагии qPCR.
2.Фаъолияти нуклеазаҳои экзогенӣ вуҷуд надорад: эндонуклеазҳои экзогенӣ ва ифлосшавии экзонуклеаза вуҷуд надорад.
Қайдҳо
1.Суръати амплификацияи полимеразаи зуди ДНК на камтар аз 1кб/10с аст.Асбобҳои гуногуни PCR дорои суръати гуногуни гармидиҳӣ ва хунуккунӣ, режимҳои назорати ҳарорат ва гузаронандагии гармидиҳӣ мебошанд ва аз ин рӯ оптимизатсияи консентратсияи праймер/зонд ва усули кор дар якҷоягӣ бо асбоби мушаххаси PCR зуд муҳим аст.
2.Ин маҳсулот қобилияти васеъ дорад ва барои ташхиси молекулавии ҳассосияти баланд мувофиқ аст.Усули се марҳилаи ПТР барои праймерҳо бо ҳарорати пасти гармкунӣ ё барои тақвияти порчаҳои дароз аз 200 бит тавсия дода мешавад.
3.Азбаски ампликонҳои гуногун самаранокии истифодаи dUTP ва ҳассосияти гуногун ба UNG доранд, реагентҳо бояд оптимизатсия карда шаванд, агар ҳассосияти ошкор ҳангоми истифодаи системаи UNG коҳиш ёбад.Лутфан, агар лозим бошад, барои дастгирии техникӣ бо мо тамос гиред.
4.Барои ҷилавгирӣ аз пурзӯр кардани маҳсулоти интиқоли ПТР, майдони махсуси таҷрибавӣ ва пипетка барои пурқувваткунӣ лозим аст.Бо дастпӯшак амал кунед ва зуд-зуд иваз кунед ва найчаи PCR-ро пас аз амплификация накушоед.
