Маҷмӯаи EndoFree Plasmid Maxi
Ин маҷмӯа барои истихроҷ аз 150 - 300 мл маҳлули бактериявӣ, ки дар як шабонарӯз парвариш карда мешавад, бо истифода аз усули мукаммали лизиси SDS-ишёрӣ барои лизи бактерия мувофиқ аст.Иқтибоси хом ба таври интихобӣ бо Scavenger беназири эндотоксин муттаҳид карда мешавад ва тавассути центрифугакунӣ барои хориҷ кардани эндотоксинҳо ҷудо карда мешавад.Сипас, мембранаи силикагель ба таври интихобӣ ба ДНК плазмидӣ дар маҳлул дар шароити намаки баланд ва пасти рН пайваст мешавад.Пас аз он илова кардани буфери шустан барои тоза кардани ифлосиҳо ва дигар ҷузъҳои бактериявӣ анҷом дода мешавад.Ниҳоят, буфери элюционии пасти намак ва рН баланд барои аз мембранаи матритсаи кремний ҷудо кардани ДНК-и плазмиди тоза истифода мешавад.Мембранаи силикагель мембранаи махсуси адсорбсияро истифода мебарад ва фарқияти миқдори адсорбсия байни сутун ва сутун хеле хурд аст ва такроршавандагӣ хуб аст.Фенол, хлороформ ва дигар реагентҳои заҳролуд талаб карда намешаванд ва инчунин марҳилаҳои боришоти этанол талаб карда намешаванд.Ин маҷмӯаро барои зуд истихроҷи 0,2 -1,5 мг ДНК-и плазмиди баланди нусхабардорӣ бо суръати истихроҷи 80% -90% истифода бурдан мумкин аст.Маҷмӯа як формулаи беназири равандро истифода мебарад, ки эндотоксинро хориҷ мекунад, мундариҷаи эндотоксин хеле паст аст ва таъсири интиқоли ҳуҷайра аъло аст.Плазмиди истихроҷшударо метавон мустақиман дар ҳазми ферментҳо, PCR, транскрипсияи in vitro, трансформатсия, пайдарпайӣ ва дигар таҷрибаҳои биологияи молекулавӣ истифода бурд.
Шароити нигоҳдорӣ
RNaseA бояд дар -30 ~ -15 ℃ нигоҳ дошта шавад ва дар ≤0 ℃ интиқол дода шавад.
Endotoxin Scavenger метавонад дар ҳарорати 2 ~ 8 ℃ барои як моҳ нигоҳ дошта шавад ва дар -30 ~ -15 ℃ барои нигоҳдории дарозмуддат нигоҳ дошта шавад.ва дар ≤0℃ интиқол дода мешавад.
Дигар ҷузъҳо бояд дар ҳарорати хонагӣ (15 ~ 25 ℃) нигоҳ дошта шаванд ва дар ҳарорати хона интиқол дода шаванд.
Компонентхо
| Компонентхо | 10RXNS |
| RNase А | 750 мкл |
| Буфери P1 | 75 мл |
| Буфери P2 | 75 мл |
| Буфери P4 | 75 мл |
| Тозакунандаи эндотоксин | 25 мл |
| Буфери PW | 2 × 22 мл |
| Буферии сил | 20 мл |
| Сутунҳои макси DNA FastPure (ҳар кадоме дар қубури коллексияи 50 мл) | 10 |
| Tube коллексияи бе эндотоксин | 2 × 5 |
RNaseA:10 мг/мл, барои тоза кардани РНК истифода мешавад.
Буфери P1:буфери боздоштани бактериявӣ, пеш аз истифодаи аввал ба буфери P1 RNaseA илова кунед.
Буфери P2:буфери лизи бактериявӣ (дар таркиби SDS/NaOH).
Буфери P4:безараргардонии буфер.
Тозакунандаи эндотоксин:эндотоксинро аз истихроҷи плазми хом самаранок хориҷ кунед.
Буфери PW:буферро бишӯед, пеш аз истифодаи аввал ҳаҷми пешбинишудаи этанолро илова кунед.
Буферии TB:буфери элюционӣ.
Сутунҳои Maxi FastPure DNA:сутунҳои адсорбсияи ДНК плазмидӣ.
Қубурҳои коллексия 50 мл:қубурҳои ҷамъоварии филтр.
Туби коллексияи бе эндотоксин:қубурҳои ҷамъоварии ДНК плазмидӣ.
Маводҳои омодашуда
Этаноли мутлақ, изопропанол, 50 мл найчаҳои мудаввари поёни центрифуга ва 50 мл эндотоксин озодқубурҳои центрифуга.
Барномаҳо
Ин маҳсулот барои истихроҷи васеъи плазмидҳо аз 150 - 300 мл маҳлули бактериявӣ мувофиқ аст.якшаба меднат карда.
Раванди таҷриба
1. 150 – 200 мл (на бештар аз 300 мл) маҳлули бактериявии дар як шабонарӯз парваришшударо гирифта, дар центрифуга кунед.тақрибан 11,000 чархзанӣ (12,000 × г) барои 1 - 2 дақиқа.Гирифтани супернатантро партоед ва бактерияҳоро ҷамъ кунед.
Δ Ҳангоми ҷамъоварии зиёда аз 50 мл маҳлули бактериявӣ, бактерияҳоро метавон тавассути илова кардани маҳлули бактериявӣ, центрифугакунӣ, партофтани супернатант ва дигар қадамҳо дар ҳамон найчаи 50 мл ҷамъоварӣ кард.
чандин маротиба.
2. Ба центрифуга 7,5 мл буфери P1 илова кунед (лутфан санҷед, ки оё RNaseA ба буфери P1 илова шудааст ё не)найчаеро, ки дар таркибаш бактерия доранд ва бо гирдоб ё пиптинг бодиққат омехта кунед.
Δ Бозгашти пурраи бактерияҳо дар ин марҳила барои ҳосил кардан муҳим аст ва пас аз дубора суспензия набояд ҷамъҳои бактериявӣ вуҷуд дошта бошанд.Агар дастаҳои бактериявӣ мавҷуд бошанд, ки ба таври дақиқ омехта карда нашудаанд, он ба лизис таъсир мерасонад, ки дар натиҷа ҳосили паст ва тозагӣ мегардад.Агар OD600 маҳлули бактериявӣ 0,65 бошад, тавсия дода мешавад, ки 7,5 мл буфери Р1 ҳангоми истихроҷ аз 150 мл маҳлули бактериявӣ истифода шавад;вақте ки OD600 0,75 аст, 8 мл буфери P1 бояд истифода шавад ва ҳаҷми буферҳои P2 ва P4 мувофиқан тағир дода шавад.Агар ҳаҷми маҳлули бактериявӣ то 200 мл зиёд карда шавад, тавсия дода мешавад, киҳаҷми буферҳои P1, P2 ва P4 мутаносибан зиёд карда шавад.
3. Ба суспензияи бактериявӣ аз қадами 2 7,5 мл буфери P2 илова кунед ва бо нарм ба боло ва поён барои 6 – 8 омехта кунед.маротиба ва дар ҳарорати хонагӣ барои 4-5 дақиқа инкубатсия кунед.
Δ Бо нарм гардонед, то ҳаматарафа омехта кунед.Гирдбод боиси порашавии геномии ДНК мегардад, ки дар натиҷа пораҳои ДНК-и геномӣ дар плазми истихроҷшуда ба вуҷуд меоянд.Дар ин вақт, маҳлул часпак ва шаффоф мешавад ва нишон медиҳад, ки бактерияҳо пурра лизис шудаанд.Давомнокии он набояд аз 5 дақиқа зиёд бошад, то нобудшавии плазмидҳо пешгирӣ карда шавад.Агар ҳалли равшан набошад, метавонад бактерияҳо аз ҳад зиёд ба вуҷуд ояндлизи нопурра, аз ин рӯ миқдори бактерияҳо бояд ба таври мувофиқ кам карда шаванд.
4. Ба суспензияи бактериявӣ аз қадами 3 7,5 мл буфери P4 илова кунед ва фавран 6 – 8 маротиба мулоим гардонед, то ки маҳлул буфери P2-ро пурра безарар созад.Дар ин вақт, бояд боришоти флокулянти сафед пайдо шавад.Дар зиёда аз 11,000 чархзанӣ (12,000 × г) дар тӯли 10 - 15 дақиқа центрифуга кунед, супернатантро бодиққат ба найчаи нави центрифугаи 50 мл мудаввар центрифуга кунед (худ тайёр карда шудааст) ва пешгирӣ кунедборишоти сафеди шинокунандаро аспират кунед.
Δ Буфери P4-ро илова кунед ва фавран гардонед, то хуб омехта кунед.Қубурро то он даме, ки боришоти сафед дар тамоми маҳлул баробар тақсим карда шавад, нигоҳ доред, то аз тавлиди боришоти маҳаллӣ, ки метавонад ба безараргардонӣ таъсир расонад, пешгирӣ кунад.Агар пеш аз центрифугакунӣ боришоти якхелаи флокулентии сафед вуҷуд надошта бошад ва пас аз центрифугакунӣ миқдори супернатант равшан набошад, қубур мумкин аст.барои 5 дақиқаи дигар центрифуга карда мешавад.
5. 0. 1 маротиба ҳаҷм (10% ҳаҷми болои нах, тақрибан 2,2 мл) Endotoxin Scavenger ба супернатант аз қадами 4 илова кунед ва гардонед, то омехта кунед.Маҳлулро дар ваннаи ях ҷойгир кунед ё ба яхи майдашуда (ё яхдони яхдон) барои 5 дақиқа гузоред, то он даме ки маҳлул аз тира ба шаффоф ва шаффоф (ё ҳанӯз ҳам) табдил ёбад.каме хира), ва баъзан якчанд маротиба омехта.
Δ Пас аз он ки пошидани эндотоксин ба супернатант илова карда мешавад, супернатант тира мешавад, аммопас аз хунук шудан дар ванна ях бояд соф (ё каме тира) шавад.
6. Пас аз он ки моеъ дар ҳарорати хонагӣ (>25℃) барои 10 – 15 дақиқа гузошта мешавад, он мисли хира мешавад.ҳарорати он то ҳарорати хонагӣ баланд мешавад.Пас аз он, супернатантро ба омехта кардан лозим аст.
Δ Агар ҳарорати хонагӣ пасттар бошад ё шумо хоҳед, ки вақти истихроҷро кам кунед, супернатантро дар ваннаи обии 37 ~ 42 ℃ барои 5 - 10 дақиқа инкубатсия кардан мумкин аст ва қадами навбатӣ пас аз супернатант гузаронида мешавад.тира мегардад.
7. Барои ҷудо кардани фаза дар ҳарорати хонагӣ (ҳарорат бояд >25 ℃ бошад) барои 10 дақиқа тақрибан 11,000 чархзанӣ (12,000 × г) центрифуга кунед.Дар марҳилаи болоии обии ДНК мавҷуд аст, дар қабати поёнии фазаи равғании кабуд эндотоксин ва дигар ифлосиҳо мавҷуданд.ИнтиқолиФазаи обии дорои ДНК ба найчаи нав вақабати равгандорро партоед.
Δ Ҳарорат ҳангоми центрифугакунӣ бояд аз 25 ℃ зиёд бошад, зеро ҷудошавии самараноки фаза ин тавр нестагар харорат хеле паст бошад.
Δ Агар ҷудокунии фаза самаранок набошад, ҳарорати центрифугаро ба 30 ℃ танзим кардан мумкин аст вавақти центрифугаро то 15 дақиқа зиёд кардан мумкин аст.
Δ Қабати равгании кабудро намаконед, зеро дар таркиби он эндотоксин ва дигар ифлосиҳо мавҷуд аст.
Механизм
Безараргардонии ресуспензияи лизис
◇ Иловаи 7,5 мл буфери P1
◇ Иловаи 7,5 мл буфери P2
◇ Иловаи 7,5 мл буфери P4
Бартараф кардани эндотоксин
◇ 0. 1 маротиба аз ҳаҷми болоии Endotoxin Scavenger илова кунед
Пайвастшавӣ ва шустан
◇ Ҳаҷми изопропанолро 0,5 маротиба илова кунед
◇ Иловаи 10 мл буфери PW
◇ Иловаи 10 мл буфери PW
Элюция
◇ Иловаи 1-2 мл буферии TB ё ddH2O-и эндотоксин
