UNG ҳассос ба ҳарорат
UNG ба ҳарорат ҳассос (TS-UNG) як ифодаи рекомбинантӣ дар E. coli мебошад.Фермент ҷудошавии урацили озодро аз ДНК-и як ва дуқатораи урацил катализ мекунад ва бар зидди РНК ғайрифаъол аст.Дар муқоиса бо ферментҳои анъанавии UNG аз пайдоиши гени E. coli, фермент TS-UNG дар ҳарорати паст (20℃~37℃) фаъолияти баландтар дорад ва ба ҳарорат ҳассос ва ба осонӣ ғайрифаъол (50℃) буда, аз таназзули амплификацияи дорои dUTP пешгирӣ мекунад. Маҳсулотро дар ҳарорати хонагӣ бо фаъолияти боқимондае, ки пас аз ғайрифаъол кардани ферментҳои анъанавии UNG боқӣ монда метавонанд, нигоҳ медоранд.Аз ин рӯ, ферментҳои TS-UNG на танҳо барои реаксияи пешгирии ифлосшавии ПТР мувофиқ аст, балки инчунин бо барномаи амплификацияи RT-PCR мувофиқат мекунад ва метавонад дар аксуламалҳои пешгирии ифлосшавии RT-PCR истифода шавад.
Аризаи тавсияшаванда
Амплификатсияи пешгирии ифлосшавӣ
Ҳолати нигоҳдорӣ
-20°C барои нигоҳдории дарозмуддат, бояд пеш аз истифода хуб омехта карда шавад, аз яхкунӣ ва обшавии зуд-зуд канорагирӣ кунед.
Буфери нигаҳдорӣ
20 мм Tris-HCl (pH 7,5), 100 мм NaCl, 0,1 мм EDTA, 1 мм DTT, стабилизатор, 50% глицерин.
Таърифи воҳид
Миқдори ферменте, ки барои таназзули 1μг ДНК-и якқатораи дорои асосҳои dU дар 1 соат дар ҳарорати 37°C лозим аст, 1 воҳиди фаъолият (U) мебошад.
Назорати сифат
1.тозагии электрофоретикии SDS-PAGE зиёда аз 98%
2.Фаъолияти таназзул, назорати партия ба партия, устуворӣ
3.Фаъолияти экзогении нуклеаза, ифлосшавии экзогении эндонуклеаза ё экзонуклеаза вуҷуд надорад.
Дастурҳо
| Компонентхо | Ҳаҷм (мкл) | Консентратсияи ниҳоӣ |
| 10 × буфери PCR (dNTP озод, Mg²+ройгон) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 мкм |
| dUTP (иваз кардани dTTP) | - | 200-600 мкм |
| 25 мм MgCl2 | 2-8 мкл | 1-4 мм |
| 5 U/μL Так | 0,25 | 1.25 У |
| 1 U/μLTS-UNG | 0,5 (0,1-0,5) | 0,5 U (0,1-0,5U) |
| 25 × Омехтаи Primerа | 2 | 1× |
| Шаблон | - | ＜1μг/реаксия |
| ddH₂O | Ба 50 | - |
Эзоҳ: a: Агар барои qPCR/qRT-PCR истифода шавад, зондҳои флуоресцентӣ бояд ба системаи реаксия илова карда шаванд.Одатан, консентратсияи ниҳоии ибтидоии 0,2 μM метавонад натиҷаҳои хуб диҳад;вакте ки реаксия суст аст, консентратсияи праймерро дар доираи 0,2-1 мкМ танзим кардан мумкин аст.Одатан, консентратсияи зонд дар доираи 0,1-0,3 мкм оптимизатсия карда мешавад.Таҷрибаҳои градиентии консентратсиониро метавон барои дарёфти беҳтарин омезиши праймер ва зонд анҷом дод.
Қайдҳо
1.Ҳарорати оптималии реаксияи ферментҳои TS-UNG нисбатан паст аст ва онро дар доираи 20℃ ~ 37℃ оптимизатсия кардан мумкин аст, вояи фермент ва вақти реаксияро дар доираи 0,1 ~ 0,5 U, 5 ~ оптимизатсия кардан мумкин аст. 10 дақиқа;ва ферментро дар раванди транскрипсияи баръакс ғайрифаъол кардан мумкин аст.
2.Он барои PCR ва RT-PCR барои пешгирии ифлосшавӣ мувофиқ аст.
3.Аз яхобшавии зуд-зуд худдорӣ кунед ва ба тағирёбии бузурги ҳарорат дучор нашавед.
4.Генҳои мухталифе, ки бояд тақвият дода шаванд, дорои самаранокии истифодаи гуногуни dUTP ва ҳассосияти ферментҳои UNG мебошанд, аз ин рӯ, агар истифодаи системаи UNG боиси паст шудани ҳассосияти ошкор шавад, системаи реаксия бояд танзим ва оптимизатсия карда шавад, агар ба шумо дастгирии техникӣ лозим бошад, лутфан тамос гиред ширкати мо.
