M-MLV Neoscript транскриптазаи баръакс

Neoscript Reverse Transscriptase як транскриптазаи баръакс мебошад, ки тавассути скрининги мутатсияи гени M-MLV пайдоиш ва ифодаи вируси лейкемияи Мурин Молоней дар E.coli ба даст оварда шудааст.Фермент фаъолияти RNase H-ро нест мекунад, таҳаммулпазирии баландтари ҳарорат дорад ва барои транскрипсияи баръакси ҳарорати баланд мувофиқ аст.Аз ин рӯ, он барои рафъи таъсири номусоиди сохтори сатҳи баланди РНК ва омилҳои ғайримуқаррарӣ ба синтези cDNA муфид буда, устуворӣ ва қобилияти синтези баръакси транскрипсия дорад.Фермент устуворӣ ва қобилияти синтези баръакси транскрипсия дорад.

Компонентхо

1.200 U/μL Neoscript транскриптазаи баръакс

2.5 × Буфери аввал (ихтиёрӣ)

* 5 × Буфери аввал дар таркиби худ dNTP-ро дар бар намегирад, лутфан ҳангоми омода кардани системаи реаксия dNTPҳоро илова кунед

Аризаи тавсияшаванда

1.Як қадами qRT-PCR.

2.Муайян кардани вируси РНК.

Ҳолати нигоҳдорӣ

-20°C барои нигоҳдории дарозмуддат, бояд пеш аз истифода хуб омехта карда шавад, аз яхкунӣ ва обшавии зуд-зуд канорагирӣ кунед.

Таърифи воҳид

Як воҳид 1 нмол dTTP-ро дар 10 дақиқа дар 37 ° C бо истифода аз poly(A)•oligo(dT) дар бар мегирад.₂₅ҳамчун қолаб/праймер.

Назорати сифат

1.тозагии электрофорезии SDS-PAGE зиёда аз 98%.

2.Ҳассосияти амплификация, назорати партия ба партия, устуворӣ.

3.Фаъолияти экзогении нуклеаза, ифлосшавии экзогении эндонуклеаза ё экзонуклеаза вуҷуд надорад

Танзими реаксия барои ҳалли аввалин реаксияи занҷир

1.Тайёр кардани омехтаи реаксия

Эзоҳҳо:a/b: Лутфан намудҳои гуногуни праймерҳоро мувофиқи ниёзҳои таҷрибавии худ интихоб кунед.

2.Дар 65 ° C барои 5 дақиқа гарм кунед ва дар ях 2 дақиқа зуд хунук кунед.

3.Ба системаи дар боло зикршуда ҷузъҳои зеринро ба ҳаҷми умумии 20 мкл илова кунед ва мулоим омехта кунед:

4. Лутфан реаксияро мувофиқи шартҳои зерин иҷро кунед:

(1) Агар Random Primer истифода шавад, реаксия бояд дар 25 ℃ барои 10 дақиқа ва сипас дар 50 ℃ барои 30 ~ 60 дақиқа гузаронида шавад;

(2) Агар Oligo dT ё праймерҳои мушаххас истифода шаванд, реаксия бояд дар 50 ℃ барои 30 ~ 60 дақиқа гузаронида шавад.

5.Дар 95 ℃ барои 5 дақиқа гарм кунед, то транскриптази баръакс Neoscript ғайрифаъол шавад ва реаксияро қатъ кунед.

6.Маҳсулоти транскрипсияи баръакс метавонанд мустақиман дар реаксияи PCR ва реаксияи миқдорӣ флуоресцентӣ истифода шаванд ё дар -20 ℃ барои муддати дароз нигоҳ дошта шаванд.

PCR Рамал:

1.Тайёр кардани омехтаи реаксия

Эзоҳҳо:a: Агар маҳлули реаксияи занҷири аввал аз ҳад зиёд илова карда шавад, реаксияи PCR метавонад боздорад.

2.Тартиби реаксияи PCR

Қайдҳо

1.Барои оптимизатсияи ҳарорати транскрипсияи баръакс дар доираи 42 ℃ ~ 55 ℃ мувофиқ аст.

2.Он устувории беҳтар дорад, барои тақвияти транскрипсияи баръакси ҳарорати баланд мувофиқ аст.Илова бар ин, он барои самаранок гузаштан аз минтақаҳои мураккаби сохтории РНК мусоид аст.Инчунин, онбарои муайянкунии миқдорӣ RT-PCR як қадами мултиплекси флуоресцентӣ мувофиқ аст.

3.Мутобиқати хуб бо ферментҳои гуногуни пурқувваткунандаи PCR ва барои реаксияҳои ҳассосияти баланд RT-PCR мувофиқ аст.

4.Муносиб барои ҳассосияти баланд як қадами флуоресцентии реаксияи миқдорӣ RT-PCR, самаранокии баланд бардоштани сатҳи муайянкунии консентратсияи пасти қолибҳо.

5.Муносиб барои сохтани китобхонаи cDNA.