Ингибитори Rnase
Ингибитори мурин RNase як ингибитори рекомбинантии RNase мурин аст, ки аз E.coli ифода ва тоза карда шудааст.Он ба RNase A, B ё C дар таносуби 1: 1 тавассути пайванди ғайриковалентӣ мепайвандад ва ба ин васила фаъолияти се ферментро бозмедорад ва РНК-ро аз таназзул муҳофизат мекунад.Аммо, он бар зидди RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H ё RNase аз Aspergillus самаранок нест.Ингибитори мурин RNase аз ҷониби RT-PCR, RT-qPCR ва IVT mRNA озмуда шуд ва бо транскриптазаҳои гуногуни тиҷоратӣ, полимеразҳои ДНК ва полимеразаҳои РНК мувофиқ буд.
Дар муқоиса бо ингибиторҳои RNase инсон, ингибитори мурин RNase ду систеинро дар бар намегирад, ки ба оксидшавӣ хеле ҳассосанд, ки боиси ғайрифаъолшавии ингибитор мегардад.Ин онро дар консентратсияи пасти DTT (камтар аз 1 мм) устувор мегардонад.Ин хусусият онро барои истифода дар реаксияҳое мувофиқ месозад, ки консентратсияи баланди DTT ба реаксия номувофиқ аст (масалан, дар вақти воқеӣ RT-PCR).
Aариза
Ин маҳсулотро дар ҳама гуна таҷрибаҳо васеъ истифода бурдан мумкин аст, ки дар он дахолати RNase барои пешгирӣ кардани таназзули РНК имконпазир аст, ба монанди:
1.Синтези риштаи якуми cDNA, RT-PCR, RT-qPCR ва ғайра.
2.РНК-ро аз таназзул ҳангоми транскрипсия/тарҷумаи in vitro муҳофизат мекунад (масалан, системаи репликатсияи вирусии in vitro).
3.Моҳияти фаъолияти RNase ҳангоми ҷудошавӣ ва тозакунии РНК.
Шароити нигоҳдорӣ
Маҳсулотро дар ҳарорати -25～-15 ℃ нигоҳ доштан мумкин аст, эътибораш 2 сол.
Буфери нигаҳдорӣ
50 мм KCl, 20 мм HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 мм DTT ва 50% глицерол.
Таърифи воҳид
Миқдори ингибитори мурин RNase барои ҷилавгирӣ аз фаъолияти 5 нг рибонуклеаза А 50% ҳамчун як воҳид (U) муайян карда шуд.
Вазни молекулавии сафеда
Вазни молекулавии ингибитори RNase мурин 50 кДа аст.
Назорати сифат
Экзонуклеаза Фаъолият:
40 U аз ингибитори RNase муррин бо 1 мкг λ - Ҳинд III ҳазми ДНК дар 37℃ дар тӯли 16 соат ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.
Фаъолияти эндонуклеаза:
40 U ингибитори RNase мурин бо 1μ г λ ДНК дар 37℃ барои 16 соат ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, медиҳад.
Ник кардан Фаъолият:
40U ингибитори мурин RNase бо 1μg pBR322 дар ҳарорати 37℃ барои 16 соат ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.
RNase Фаъолият:
40U ингибитори RNase мурин бо 1,6μг РНК MS2 барои 4 соат дар 37℃ ҳеҷ таназзулеро, ки тавассути электрофорези гели агароз муайян карда мешавад, ба вуҷуд намеорад.
E.ДНК coli:
40 U ингибитори RNase мурин барои мавҷудияти ДНК-и геномии E. coli бо истифода аз TaqMan qPCR бо праймерҳои мушаххас барои макони E. coli 16S rRNA тафтиш карда мешавад.Ифлосшавии ДНК-и геномии E. coli ≤ 0,1 pg/40 U аст.
Nотеs
1. Тағйирёбии шадид ё шӯриш ба ғайрифаъолшавии фермент оварда мерасонад.
2.Дипазони ҳарорати оптималии ин ингибитор 25-55 ℃ буд ва он дар 65 ℃ ва болотар ғайрифаъол карда шуд.
3.Фаъолиятҳои RNase H, RNase 1 ва RNase T1 аз ҷониби ингибитори мурин RNase монеъ нашуданд.
4.Дар монеъшавии фаъолияти RNase дар доираи васеи pH ёфт (pH 5-9 ҳама фаъол буданд), ва баландтарин фаъолият дар pH 7-8 мушоҳида шуд.
5. Азбаски рибонуклеазаҳо маъмулан фаъолиятро дар шароити денатуризатсия нигоҳ медоранд, бояд эҳтиёт шавад, ки молекулаҳои ингибитори RNase, ки бо рибонуклеаза мураккаб шудаанд, пешгирӣ карда шаванд.Барои пешгирии ифшои рибонуклеазаи фаъол, бояд аз ҳарорати баландтар аз 50 °C ва консентратсияи баланди мочевина ё дигар агентҳои денатуратсия пешгирӣ карда шаванд.
