Транскриптазаи баръакси RTL
Транскриптазаи баръакси RTL як полимеразаи ДНК-и аз қолаби РНК вобаста аст, ки фаъолияти 3'→5' экзонуклеаза надорад ва дорои фаъолияти RNase H мебошад.Ин фермент метавонад РНК-ро ҳамчун қолаб барои синтез кардани риштаи комплементарии ДНК истифода барад, ки онро метавон ба синтези аввалини cDNA истифода бурд, махсусан барои RT-LAMP (ба воситаи ҳалқаи изотермикӣ амплификация).Дар муқоиса бо RTL транскриптазаи баръакс 1.0, ҳассосият ба таври назаррас беҳтар шудааст, устувории гармӣ қавитар аст ва реаксия дар 65 ° C устувортар аст.Транскриптазаи баръакси RTL (глицероли озод) метавонад барои тайёр кардани доруҳои лиофилизатсияшуда, реагентҳои лиофилизатсияшудаи RT-LAMP ва ғайра истифода шавад.
Таърифи воҳид
Як воҳид 1 нмол dTTP-ро дар 20 дақиқа дар ҳарорати 50 ° C бо истифода аз поли(A)•oligo(dT)25 ҳамчун шаблон-праймер ба маводи бо кислотаҳо рехташаванда дохил мекунад.
Компонентхо
| Компонент | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Транскриптазаи баръакси RTL (бе глицерол) (15U/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| Буфери 10×HC RTL | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Ҳолати нигоҳдорӣ
Интиқол дар зери 0 ° C ва дар -25 ° C ~ -15 ° C нигоҳ дошта мешавад.
Назорати сифат
- Фаъолияти боқимондаEнонуклеаза:Реаксияи 50 мкл, ки дорои 1 мкг λДНК ва 15 воҳиди RTL2.0 дар давоми 16 соат дар 37 ℃ инкубатсия шудааст, ҳамон намунаи назорати манфиро тавассути электрофорези гел нишон медиҳад.
- Фаъолияти боқимондаЭкзонуклеаза:Реаксияи 50 мкл, ки дорои 1 мкг λДНК-и Ҳинд Ⅲ ҳазмшуда ва 15 воҳиди RTL2.0 дар тӯли 16 соат дар 37 ℃ инкубатсия шудааст, ҳамон намунаи назорати манфӣ тавассути электрофорези гелро нишон медиҳад.
- Фаъолияти боқимондаНикас:Реаксияи 50 мкл, ки дорои 1 мкг pBR322-и олӣ ва 15 воҳиди RTL2.0, ки дар тӯли 4 соат дар 37°C инкубатсия карда шудааст, ҳамон намунаи назорати манфии электрофорези гелро нишон медиҳад.
- Фаъолияти боқимондаRNase:Реаксияи 10 мкл дорои 0,48 мкг РНК MS2 ва 15 воҳиди RTL2.0, ки дар давоми 4 соат дар 37°С инкубатсия карда шудааст, ҳамон намунаи назорати манфӣ тавассути электрофорези гелро нишон медиҳад.
- E. coli gДНК:Бо чен карда шудаастE.coliмаҷмӯаҳои мушаххаси муайянкунии HCD, 15 воҳиди RTL2.0 камтар аз 1-ро дар бар мегирадE. coliгеном.
Танзимоти реаксия
Протоколи синтези cDNA
| Компонентхо | Ҳаҷм |
| Шаблон РНК а | ихтиёрӣ |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) ё омехтаи Random Primer (60uM) | 2 мкл |
| Mix dNTP (ҳар кадомаш 10 мм) | 1 мкл |
| Ингибитори RNase (40U/uL) | 0,5 мкл |
| Транскриптазаи баръакс RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 мкл |
| Буфери 10×HC RTL | 2 мкл |
| Оби бенуклеаз | То 20 мкл |
Эзоҳҳо:
1) Микдори тавсияшудаи умумии РНК 1ng~1μg аст
2) Микдори тавсияшудаи mRNA 50ng ~ 100ng буд
Термо-велосипедронӣ Шароит барои як реҷа вокуниш:
| Ҳарорат (°C) | Вақт |
| 25 °Ca | 5 дақиқа |
| 55 °C | 10 дақиқаb |
| 80 °C | 10 дақиқа |
Эзоҳҳо:
1) Агар омехтаи Random Primer истифода шавад, як қадами инкубатсия дар 25 ° C.
2) Агар омехтаи праймери мақсаднок истифода шавад, як қадами инкубатсия дар 55 ° C барои 10 ~ 30 дақиқа.
Протоколи RT-LAMP
| Компонентхо | Ҳаҷм | Консентратсияи ниҳоӣ |
| Шаблон РНК | ихтиёрӣ | ≥10 нусха |
| Mix dNTP (10mM) | 3,5 мкл | 1,4 мм |
| Примерҳои FIP/BIP (25×) | 1 мкл | 1,6 мкм |
| Primers F3/B3 (25×) | 1 мкл | 0,2 мкм |
| Примерҳои LoopF/LoopB (25×) | 1 мкл | 0,4 мкм |
| Ингибитори RNase (40U/μL) | 0,5 мкл | 20 U/реаксия |
| Транскриптазаи баръакс RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 мкл | 7.5 U/реаксия |
| Bst V2 ДНК Полимераз (8U/мкл) | 1 мкл | 8 U/реаксия |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мкл | 6 мм (Ҷамъ 8 мм) |
| Буфери 10×HC RTL (ё буфери 10×HC Bst V2) | 2,5 мкл | 1 × (2мМ Mg2+) |
| Оби бенуклеаз | То 25 мкл | - |
Эзоҳҳо:
1) Бо гирдоби омехта омехта кунед ва барои ҷамъоварӣ ба муддати кӯтоҳ центрифуга кунед.Инкубатсия дар ҳарорати доимӣ дар 65 ° C барои 1 соат.
2) Ду буфер бо ҳам корношояманд ва таркиби якхела доранд.
Қайдҳо
1.Ин маҳсулот ҳангоми нигоҳдорӣ дар -20 °C як сахти сафедро ташкил медиҳад.Онро аз -20 ° C гиред ва тақрибан 10 дақиқа дар рӯи ях гузоред.Пас аз гудохтан, онро бо ларзиш ва омехта истифода бурдан мумкин аст.
2.Маҳсулоти cDNA метавонад дар -20°C ё -80°C нигоҳ дошта шавад ё фавран барои реаксияи PCR истифода шавад.
3. Барои пешгирии ифлосшавии RNase, лутфан майдони озмоиширо тоза нигоҳ доред ва ҳангоми кор дастпӯшакҳо ва ниқобҳои тоза пӯшед.
