Маҷмӯаи мини истихроҷи ДНК
Ин маҷмӯа системаи оптимизатсияшудаи буферӣ ва технологияи тозакунии сутуни силикагелиро қабул мекунад, ки метавонад порчаҳои ДНК-и 70 bp - 20 kb аз консентратсияи гуногуни TAE ё TBE агарозро барқарор кунад.Сутуни адсорбсияи ДНК метавонад ДНК-ро дар ҳолати намакҳои баланд махсус адсорб кунад.Илова бар ин, маҷмӯа метавонад мустақиман пораҳои ДНК-ро аз маҳсулоти PCR, системаҳои реаксияи ферментативӣ ё маҳсулоти хоми ДНК, ки бо усулҳои дигар ба даст оварда шудаанд, тоза карда, ифлосиҳо ба монанди сафедаҳо, дигар пайвастагиҳои органикӣ, ионҳои намаки ғайриорганикӣ ва праймерҳои олигонуклеотидро тоза кунад.Он метавонад кафолат диҳад, ки тозакунӣ дар давоми 10-15 дақиқа анҷом дода мешавад.ДНК-и тозашударо мустақиман барои ligation, трансформатсия, ҳазми ферментҳо, транскрипсияи in vitro, PCR, пайдарпайкунӣ, микроинъекция ва ғайра истифода бурдан мумкин аст.
Шароити нигоҳдорӣ
Дар -15 ~ -25 ℃ нигоҳ доред ва дар ҳарорати хона интиқол диҳед.
Компонентхо
| Компонентхо | (100 rxns) |
| ММД буферӣ | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Буфери элюционӣ | 20 мл |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
ММД буферӣ:Буфери пайвасткунандаи ДНК.
Буфери GW:буфери шустан;пеш аз истифода ба андозаи дар шиша нишондодашудаи этаноли мутлақ илова кунед.
Буфери элюционӣ:Элюция.
FastPure DNA Mini Columns-G:Сутунҳои адсорбсияи ДНК.
Қубурҳои коллексия 2 мл:Қубурҳои ҷамъоварӣ барои филтратсия.
Маводҳои омодашуда
1,5 мл найчаҳои стерилизатсияшуда, этаноли мутлақ ва изопропанол (вақте ки порчаи ДНК ≤100 bp аст, 1 ҳаҷм илова кунед.
изопропанол то 1 ҳаҷм гел), ваннаи об.
Раванди таҷриба
80 мл этанол илова кунед, то буфери GW-ро маҳлул кунед, тавре ки пеш аз истифода дар теги нишон дода шудааст, дар ҳарорати хона нигоҳ доред.
Механизм
1. Маҳлули реаксияи PCR
Нақшаи истихроҷи гел: Илова кардани ҳаҷми баробари буфери GDP реаксияи PCR схемаи барқарорсозии маҳлул:5 маротиба ҳаҷми буферро илова кунед
2. ММД Ҳаҷми гелро ҳисоб кунед(100 μл ба 100 мг баробар аст)
Гельро маҳлул кунед
3. Пеш аз 50 ~ 55 гарм кунед℃
4. Шустани баста
300 мкл ММД-и буфериро илова кунед*
700 мкл буфери ГВт илова кунед
700 мкл буфери ГВт илова кунед
5. Элут
Ба 20 – 30 мкл буфери Элюционӣ ё оби деионизатсияшуда илова кунед
Эзоҳҳо* барқароркунии моеъи реаксияи PCR бе ин қадам
Барномаи истихроҷи гел
1. Пас аз электрофорези ДНК барои фраксиябандии порчаҳои ДНК рахи ягонаи порчаи ДНК-ро аз гели агароз зери нури ултрабунафш аксиз кунед.Тавсия дода мешавад, ки коғази ҷаббидаро барои азхудкунии намии намоёни гел ва кам кардани андозаи буридаи гел тавассути хориҷ кардани агарози иловагӣ то ҳадди имкон истифода баред.Барои ҳисоб кардани ҳаҷми он буридаи гелро (бе найчаи микроцентрифуга) вазн кунед: Ҳаҷми гелс 100 мг тақрибан 100 мкл аст, агар зичии он 1 г/мл бошад.
2. Ҳаҷми баробари GDP-и буфериро илова кунед, дар 50~55℃ барои 7-10 дақиқа инкубатсия кунед (мувофиқи андозаи гел, вақти инкубатсияро то пурра об шудани гел танзим кунед).Дар давоми инкубатсия найчаро 2 маротиба гардонед.
Δ Иловаи 1-3 ҳаҷми ММД буферӣ ба самаранокии барқарорсозии ДНК таъсир намерасонад.Агар порчаи ДНК барои барқароршавӣ <100 bp, 3 ҳаҷми ММД-и буфериро илова кардан лозим аст;вақте ки буридаи гел пурра гудохта шуд, 1 ҳаҷми изопропанолро илова кунед ва ҳаматарафа омехта кунед, пас ба қадами оянда идома диҳед.
3. Барои ба қаъри найча овардани намуна ба таври мухтасар центрифуга кунед, FastPure DNA Mini Columns-G-ро ба қубурҳои ҷамъоварӣ 2 мл гузоред, маҳлулро бодиққат дар як маротиба ба ҳадди аксар 700 мкл интиқол диҳед.
вақт ба сутунҳои филтратсия, центрифуга дар 12,000 чархзанӣ (13,800 X г) барои 30-60 сония.
4. Филтрро партоед ва ба сутун 300 мкл GDP буфериро илова кунед, дар ҳарорати хонагӣ барои 1 дақиқа инкубатсия кунед, дар 12,000 чархзанӣ (13,800 X г) барои 30-60 сония центрифуга кунед.
5. Филтрро партоед ва ба сутун 700 мкл буфери GW илова кунед (санҷед, ки оё этаноли мутлақ илова карда шудааст!) ва центрифуга дар 12,000 чархзанӣ (13,800 X г) барои 30-60 сония.
Δ Лутфан, буфери GW-ро дар атрофи девори сутуни адсорбсия илова кунед ё сарпӯши қафои Buffer GW-ро илова кунед ва онро 2-3 маротиба чаппа карда омехта кунед, то намакро, ки ба девори қубур часпида буд, пурра шуста шавад.
6. Қадами 5-ро такрор кунед.
Δ Ду маротиба оббозӣ бо буфери GW метавонад кафолат диҳад, ки намак пурра нест карда шавад ва таъсирро ба таҷрибаҳои минбаъда бартараф созад.
7. Филтрро партоед ва сутуни холиро дар 12,000 чархзанӣ (13,800 X г) барои 2 дақиқа центрифуга кунед.
8. Сутунро ба найчаи тозаи микроцентрифугаи 1,5 мл гузоред, ба маркази мембранаи сутун 20 - 30 мкл буфери элютсионӣ илова кунед, 2 дақиқа инкубатсия кунед ва сипас дар 12,000 чархзанӣ (13,800 X г) барои 1 дақиқа центрифуга кунед.Сутунро партоед, ДНК-и гирифташударо дар -20 нигоҳ доред.
Δ Интиқоли супернатанти қадами 8 ба сутун барои дубора элюсия ва пеш аз гарм кардани буфери Элюционӣ то 55 (вақте ки порчаи ДНК >3 кб) метавонад барои баланд бардоштани самаранокии барқарорсозӣ муфид бошад.
Барномаи барқарорсозии маҳсулоти PCR
Ин протокол барои тоза кардани порчаҳои ДНК аз маҳсулоти ПТР, системаи реаксияи ферментативӣ ва дигар маҳсулоти хоми ДНК (аз ҷумла ДНК генетикӣ) татбиқ мешавад.Ин маҳлул метавонад нуклеотидҳои гуногун, праймерҳо, димерҳои ибтидоӣ, молекулаҳои намак, ферментҳо ва дигар ифлосҳоро самаранок тоза кунад.
1. Маҳсулоти PCR, маҳлули реаксияи ферментӣ ва дигар маҳсулоти хоми ДНК-ро ба таври мухтасар центрифуга кунед.Ҳаҷми онҳоро бо пипетка ҳисоб кунед ва ба найчаи стерилизатсияшудаи 1,5 мл ё 2 мл интиқол диҳед.ddH2O илова кунед, то ҳаҷм то 100 мкл;дар ҳоле, ки барои ДНК-и геномии дорои консентратсияи баланд, об кардан то 300 мкл бо ddH2O барои беҳтар кардани самаранокии барқарорсозӣ кӯмак мекунад.
2. 5 ҳаҷми ММД-и буфериро илова кунед, бо инвертатсия ё гирдоб кардан бодиққат омехта кунед.Агар порчаи ДНК-и мавриди таваҷҷуҳ >100 bp, ҳаҷми иловагии 1,5 (намунаҳо + ММД буферӣ) этанолро илова кардан лозим аст.
3. Сутунро дубора ба найчаи ҷамъоварӣ гузоред, омехтаро ба сутун интиқол диҳед, дар 12,000 чархзанӣ (13,800 × г) барои 30 – 60 сония центрифуга кунед.Агар ҳаҷми маҳлули омехта >700 мкл бошад, сутуни адсорбсияро дубора ба найчаи ҷамъоварӣ гузоред, маҳлули боқимондаро ба сутуни адсорбсия интиқол диҳед ва дар 12,000 чархзанӣ (13,800 × г) барои 30 – 60 сония центрифуга кунед.
4. Намоиши навбатӣ ба қадами 5 – 8 барномаи истихроҷи 08- 1/Gel дахл дорад.
Барномаҳо
Консентратсияи гуногуни гели агарози TAE ё TBE;Маҳсулоти PCR, системаҳои реаксияи ферментативӣ ё дигар маҳсулоти хоми ДНК, ки бо усулҳои гуногун ба даст оварда шудаанд.Порчаҳои барқароршуда аз70 bp -20 кб.
Қайдҳо
Танҳо барои истифодаи тадқиқотӣ.На барои истифода дар расмиёти ташхис.
1. 80 мл этанол илова кунед, то буфери GW-ро маҳлул кунед, тавре ки дар теги пеш аз истифода нишон дода шудааст, дар ҳарорати хонагӣ нигоҳ доред.
2. Агар ММД-и буферӣ ҳангоми нигоҳдории ҳарорати паст ба осонӣ борид, он метавонад дар ҳарорати хонагӣ барои як давраи пеш аз истифода ҷойгир карда шавад.Дар ҳолати зарурӣ, онро дар ваннаи обии 37℃ то пурра об шудани боришот пешакӣ гарм кардан мумкин аст ва пас аз омехта истифода бурдан мумкин аст.
3. Ҳарорати ваннаи обро пешакӣ ба 50 ~ 55 ℃ муқаррар кунед.
4. Дар барномаи истихроҷи 08-1/Gel қадами 1, кам кардани андозаи буридаи гел вақти обшавиро ба таври назаррас коҳиш медиҳад ва самаранокии барқароркуниро зиёд мекунад (ДНК-и хаттӣ ҳангоми таъсири доимӣ дар ҳарорати баланд ба осонӣ гидролиз мешавад).Гель ДНК-ро дар муддати тӯлонӣ дар зери нури ултрабунафш қарор надиҳед, зеро нури ултрабунафш метавонад ба ДНК зарар расонад.
5. Дар марҳилаи 2 барномаи истихроҷи 08- 1/Gel гелро комилан ҳал кунед, вагарна ба самаранокии барқарорсозии ДНК таъсири ҷиддӣ мерасонад.
6. Буфери Элюционӣ ё ddH2O-ро то 55℃ пешакӣ гарм кунед, ки барои беҳтар кардани самаранокии элюсияи ДНК муфид аст.Тавсия дода мешавад, ки ДНК-ро дар элюенти 2,5 мм Tris-HCl, pH 7,0 - 8,5 нигоҳ доред.
