Маҷмӯаи PCR мустақими растанӣ

Рақами гурба: HCR2020A

Маҷмӯаи PCR бевоситаи растанӣ барои тақвияти мустақими баргҳои растанӣ, тухмҳо ва ғайра мувофиқ аст ва метавонад барои скрининги баландсуръати намунаҳои растанӣ, ки полисахаридҳо ва полифенолҳо надоранд, истифода шавад.Полимеразаи мустақими амплификацияи ДНК дар асоси эволютсияи равонашуда нисбат ба ингибиторҳои PCR дар растаниҳо таҳаммулпазирии олӣ дорад.Дар ҳамин ҳол, он иҷрои баланди амплификацияро нигоҳ медорад, ки барои тақвияти порчаҳои ДНК дар ҳудуди 5 кб мувофиқ аст.Буфери беназири Lysis A дар маҷмӯа метавонад барои лизиси бофтаҳои тару тоза ё яхкардашудаи растанӣ истифода шавад.Онро кор кардан осон аст ва лизатро метавон ҳамчун қолаби амплификатсия бидуни тозакунӣ истифода бурд.Система дорои агентҳои муҳофизатӣ мебошад, ки имкон медиҳанд, ки намунаҳои хом пас аз яхкунӣ ва обшавии такрорӣ ба таври муассир тақвият дода шаванд.2 × Plant Direct Master Mix танҳо бояд праймерҳо ва қолибҳоро илова кунад, то реаксияи амплификатсияро иҷро кунад ва ба ин васила амалиёти пиптингро коҳиш диҳад ва гузариши ошкор ва такрорпазирии натиҷаҳоро беҳтар созад.

Компонентхо

*Буфери лизиси бевоситаи растании В реагенти ихтиёрӣ мебошад, ки барои безарар кардани буфери лизиси мустақими растании А барои дароз кардани вақти нигоҳдории намунаҳо истифода мешавад.Онро мувофиқи вазъияти воқеӣ истифода бурдан мумкин аст.

Шароити нигоҳдорӣ

2 × Миксҳои мустақими растанӣ, дар -30 ~ -15 ℃ нигоҳ доред ва аз яхкунӣ ва обшавии такрорӣ худдорӣ кунед;Буфери мустақими лизиси растанӣ, дар -30 ~ -15 ℃ ё 2 ~ 8 ℃ нигоҳ доред.

Раванди таҷриба

Коркарди намуна–Барги растанӣ

Усули мустақим:Тавсия дода мешавад, ки баргҳои ҷавонро истифода баранд.Барои ба даст овардани намунаи хурд ва якхела аз сӯрохии диаметри собит 0,5 – 3 мм истифода баред ва сипас бевосита намунаро ба системаи PCR илова кунед (системаи 50 мкл тавсия дода мешавад).Аҳамият диҳед, ки намуна дар маҳлули PCR ҷойгир аст, на ба девори қубур.Агар ПЗР мустақим барои пурзӯр кардани пораҳои дароз ва намунаҳои мураккаб истифода шавад, истифодаи намунаи диаметри хурдтар (0,5 – 1 мм) ҳамчун қолаб метавонад барои ба даст овардани натиҷаҳои беҳтар мусоидат кунад.

Усули лизиси дастос:Тавсия дода мешавад, ки баргҳои ҷавонро истифода баранд.Як пораи хурди баргро (диаметраш тақрибан 1 – 3 мм) гиред, онро дар 20 мкл Plant Direct Lysis Buffer Ab ҷойгир кунед ва ба қадри имкон онро майда кунед (ин қадамро тавассути фишурдани барг бо нӯги пипеткаи 100 мкл анҷом додан мумкин аст. барои машхур кардани намуна) .Агар миқдори зиёди бофтаи барг истифода шавад (аз 7 мм зиёд набошад), ҳаҷми буфери ҳалкунандаро то 50 мкл зиёд кунед.Пас аз хок кардани баргҳо, маҳлул бояд сабз пайдо шавад.Пас аз центрифугаи кӯтоҳ, 1 мкл супернатантро ба системаи PCR ҳамчун қолаби реаксия илова кунед.

Усули лизиси гармидиҳӣ:Тавсия дода мешавад, ки баргҳои ҷавонро истифода баранд.Як пораи хурди баргро (диаметри тақрибан 1 – 3 мм) гиред, онро дар буфери 20 мкл растании бевоситаи лизиси А ҷойгир кунед ва онро дар 95°C барои 5 – 10 дақиқа гарм кунед.Муддати лизисро барои баргҳое, ки лизисашон душвор аст (на бештар аз 20 дақиқа) ба таври мувофиқ дароз кардан мумкин аст.Агар миқдори зиёди бофтаи барг истифода шавад (аз 7 мм зиёд набошад), ҳаҷми буфери ҳалкунандаро то 50 мкл зиёд кунед.Пас аз гармкунӣ, ба таври мухтасар центрифуга кунед ва ба системаи ПТР ҳамчун қолаби реаксия 1 мкл супернатант илова кунед.

Коркарди намуна- Тухми растанӣ

Усули лизиси дастос:Барои буридани тухмии диаметри 5 мм аз скальпел истифода баред, онҳоро ба 100 мкл буфери бевоситаи растании Lysis A илова кунед ва намунаро бо нӯги пипетка ё дигар асбобҳо майда кунед.Гирдобро кӯтоҳ кунед ва бигзоред, ки дар ҳарорати хонагӣ 3-5 дақиқа истад.Боварӣ ҳосил кунед, ки намунаи тухмӣ дар буфери ҳалкунанда ғарқ шудааст.Пас аз центрифугаи кӯтоҳ, 1 мкл супернатантро ба системаи PCR ҳамчун қолаби реаксия илова кунед.

Усули лизиси гармидиҳӣ:Барои буридани тухмии диаметри 5 мм бо скальпел истифода баред, онҳоро ба 100 мкл буфери бевоситаи растанӣ лизиси А илова кунед ва дар 95°С барои 5 – 10 дақиқа гарм кунед.Муддати лизисро барои баргҳое, ки лизисашон душвор аст (на бештар аз 30 дақиқа) ба таври мувофиқ дароз кардан мумкин аст.Пас аз гармкунӣ, ба таври мухтасар центрифуга кунед ва ба системаи ПТР ҳамчун қолаби реаксия 1 мкл супернатант илова кунед.

а.Барои буридани намунаҳои андозаи мувофиқ кайчи ё дигар асбобҳоро низ истифода бурдан мумкин аст;агар штамп ё кайчи дубора истифода шавад, пеш аз ҳар истифода онҳо бояд бо маҳлули гипохлорити натрийи 2% тоза карда шаванд, то ифлосшавии байни намунаҳо пешгирӣ карда шавад.

б.Боварӣ ҳосил кунед, ки буфери бевоситаи растанӣ пеш аз истифода пурра гудохта шудааст.Агар буфер часпак бошад ё боришот дошта бошад, онро дар 37℃ гарм кардан мумкин аст, то пеш аз истифода пурра гудохта шавад.

в.Ҳаҷми қолибро дар системаи реаксия мувофиқи фарқияти ҳаҷми маводи растанӣ ва иловашуда илова кардан мумкин аст.

Буфери мустақими лизиси растанӣ

Буфери мустақими лизиси растанӣ A, ки дар ин маҳсулот мавҷуд аст, барои озод кардани геноми аксари бофтаҳои растанӣ ба таври қатъӣ оптимизатсия карда шудааст ва барои нигоҳдории кӯтоҳмуддати растаниҳои хом дар ҳарорати 4 ℃ мувофиқ аст.Агар намуна барои муддати тӯлонӣ нигоҳ дошта шавад (масалан, 1-2 моҳ), тавсия дода мешавад, ки супернатантро ба найчаи нави EP интиқол диҳед ва онро дар -20 ℃ нигоҳ доред.Барои мӯътадилтар нигоҳ доштани намунаҳо, ба супернатанти интиқолшуда миқдори баробари растании Lysis Buffer B-ро илова кунед, хуб омехта кунед ва дар -20 ℃ нигоҳ доред.Мӯҳлати нигоҳдории устувор вобаста ба намунаҳои растанӣ ва давлатҳо фарқ мекунад.

Системаи реаксия

а.Он дорои Mg²⁺дар консентратсияи ниҳоии 2 мм.

б.Тавсия дода мешавад, ки консентратсияи ниҳоии 0,4μM барои ҳар як праймер истифода шавад.Истифодаи аз ҳад зиёди праймерҳо боиси афзоиши амплификацияи ғайримуқаррарӣ мегардад.

в.Миқдори намунаи истифодашударо вобаста ба вазъияти воқеӣ танзим кардан мумкин аст.Миқдори дар реаксияи ягонаи намунаи лизи хом истифодашавандаро метавон аз 2% то 20% аз ҳаҷми умумии реаксия танзим кард.Истифодаи намунаҳои аз ҳад зиёд метавонад боиси нокомии тақвият гардад.

Барномаи реаксия

а.Денатуратсияи ибтидоӣ (98 ℃, 5 дақиқа) ба лизиси бофтаи растанӣ мусоидат мекунад ва ДНК-и геномиро хориҷ мекунад, ки метавонад барои тақвияти ПТР истифода шавад.Вақтро кӯтоҳ накунед ё ҳароратро паст накунед.

б.Тавсия дода мешавад, ки онро ба арзиши ибтидоии Tm баробар кунед ё аз арзиши Tm 2 ~ 4℃ баландтар таъин кунед.Полимеразаи амплификацияи мустақими ДНК, ки дар ин маҳсулот истифода мешавад, аз полимеразаи муқаррарии Taq DNA фарқ мекунад ва барои ҳарорати гармкунии реаксия талаботи махсус дорад; Истифодаи ҳарорати баланди гармкунӣ метавонад амплификацияи ғайримуқаррариро ба таври муассир коҳиш диҳад ва самаранокии тақвиятро беҳтар кунад.Барои қолибҳои мураккаб, тақвияти муассирро тавассути танзими ҳарорати гармкунӣ ва дароз кардани вақти тамдид ба даст овардан мумкин аст.

в.Агар дарозии маҳсулоти пурқувваткунӣ ≤1 кб бошад, вақти дарозкунӣ 30 сония/кб муқаррар карда мешавад;агар дарозии маҳсули пурқувваткунӣ >1 кб бошад, вақти дарозкунӣ 60 сония/кб муқаррар карда мешавад.

г.Барои намунаҳои мураккаб ё намунаҳое, ки ҳосилнокии пасти амплификация доранд, шумораи давраҳоро ба таври мувофиқ ба 40 -50 давра зиёд кардан мумкин аст.

Барномаҳо

Он барои тақвияти мустақими бофтаҳои растанӣ ва скрининги баландсуръати намунаҳои растанӣ, ки полисахаридҳо ва полифенолҳо надоранд, татбиқ мешавад.

Қайдҳо

Танҳо барои истифодаи тадқиқотӣ.На барои истифода дар расмиёти ташхис.

1. Барои амплификацияи хоми растанӣ ё амплификацияи мустақим, тавсия дода мешавад, ки ДНК-и геномии тозашуда ҳамчун назорати мусбӣ пеш аз оғози таҷриба истифода шавад, то дурустии система, праймерҳо ва амалиётҳоро таъмин кунад.

2. Полимеразаи амплификацияи мустақими ДНК, ки дар ин маҷмӯа истифода мешавад, дорои фаъолияти пурқуввати proofreading.Агар клонкунии ТА лозим бошад, тавсия дода мешавад, ки пеш аз илова кардани аденин ДНК-ро тоза кунед.

3. Роҳнамои тарҳрезии ибтидоӣ:

а.Тавсия дода мешавад, ки пойгоҳи охирин дар охири 3'-и праймер бояд G ё C бошад.

б.Дар 8 пояи охирин дар охири 3'-и ибтидо аз номувофиқатии пайдарпай бояд пешгирӣ карда шавад.в.Аз сохторҳои мӯй дар 3′ охири праймер худдорӣ кунед.

г.Тафовут дар арзиши Tm-и праймери пеш ва праймери баръакс набояд аз 1℃ зиёд бошад ва арзиши Tm бояд ба 60 ~ 72℃ тасҳеҳ карда шавад (барои ҳисоб кардани арзиши Tm Primer Premier 5 тавсия дода мешавад).

д.Пасиҳамоии иловагии праймер, ки бо қолаб мувофиқ нестанд, ҳангоми ҳисоб кардани арзиши ибтидоии Tm набояд дохил карда шаванд.

f.Тавсия дода мешавад, ки миқдори GC-и праймер 40% -60% бошад.

г.Тақсимоти умумии A, G, C ва T дар праймер бояд то ҳадди имкон баробар бошад.Аз истифодаи минтақаҳое, ки дорои мундариҷаи баланди GC ё AT мебошанд, худдорӣ кунед.

ч.Аз мавҷудияти пайдарпайии иловагии 5 ё зиёда пойгоҳҳо ё дар дохили праймер ё байни ду праймер худдорӣ кунед ва аз мавҷудияти пайдарпайии иловагии 3 ё бештар аз пойгоҳҳо дар охири 3'-и ду праймер пешгирӣ кунед.

i.Функсияи NCBI BLAST-ро барои санҷидани хусусияти праймер барои пешгирӣ кардани амплификацияи ғайримуқаррарӣ истифода баред.