Урацил ДНК гликозилаза
Uracil-DNA Glycosylase (UNG ё UDG) як клони рекомбинатии E.coli бо вазни молекулавии 25 кДа мебошад.Он ҷудошавии урацили озодро аз ДНК-и якқатор ва дуқабата дорои урацил катализ мекунад ва бар зидди РНК ғайрифаъол аст ва метавонад барои пешгирии ифлосшавии маҳсулоти амплификацияи ПТР истифода шавад.Принсипи амал ба он асос ёфтааст, ки агар dUTP дар реаксияи ПТР ба ҷои dTTP иваз карда шавад ва маҳсулоти пурқувваткунандаи ПТР, ки дорои асосҳои dU дорад, фермент метавонад ба таври интихобӣ пайванди гликозидии асосҳои U-ро дар якқатор ва дуқатор вайрон кунад. ДНК ва таназзули маҳсулоти амплификацияи PCR.
Аризаи тавсияшаванда
Амплификатсияи пешгирии ифлосшавӣ
Ҳолати нигоҳдорӣ
-20°C барои нигоҳдории дарозмуддат, бояд пеш аз истифода хуб омехта карда шавад, аз яхкунӣ ва обшавии зуд-зуд канорагирӣ кунед.
Буфери нигаҳдорӣ
20 мм Tris-HCl (pH 8.0), 150 мм NaCl, 1 мм EDTA, 1 мм DTT, стабилизатор, 50% глицерин.
Таърифи воҳид
Миқдори ферменте, ки барои таназзули 1 мкг ДНК-и якқатораи дорои асосҳои dU дар 1 соат дар ҳарорати 37°C лозим аст, 1 воҳид аст.
Назорати сифат
1.тозагии электрофоретикии SDS-PAGE зиёда аз 98%
2.Ҳассосияти амплификация, назорати партия ба партия, устуворӣ
3.Пас аз коркарди 1U UNG дар 50 ℃ барои 2 дақиқа, қолаби дорои U аз 103 нусха бояд комилан хароб карда шавад ва ҳеҷ гуна маҳсулоти пурқувват истеҳсол карда намешавад.
4.Фаъолияти экзогении нуклеаза вуҷуд надорад
Дастурҳо
| Компонентхо | Ҳаҷм (мкл) | Консентратсияи ниҳоӣ |
| 10 × буфери PCR (dNTP озод, Mg²+ройгон) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 мкм |
| dUTP (иваз кардани dTTP) | - | 200-600 мкм |
| 25 мм MgCl2 | 2-8 мкл | 1-4 мм |
| 5 U/μL Так | 0,25 | 1.25 У |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Омехтаи Primerа | 2 | 1× |
| Шаблон | - | ＜1μг/реаксия |
| ddH₂O | Ба 50 | - |
Шарҳ: a: Агар барои qPCR/qRT-PCR истифода шавад, зондҳои флуоресцентӣ бояд ба системаи реаксия илова карда шаванд.Одатан, консентратсияи ниҳоии ибтидоии 0,2 μM метавонад натиҷаҳои хуб диҳад;вакте ки реаксия суст аст, консентратсияи праймерро дар доираи 0,2-1 мкМ танзим кардан мумкин аст.Одатан, консентратсияи зонд дар доираи 0,1-0,3 мкм оптимизатсия карда мешавад.Таҷрибаҳои градиентии консентратсиониро метавон барои дарёфти беҳтарин омезиши праймер ва зонд анҷом дод.
Қайдҳо
1.Ферментҳои UNG-ро барои хориҷ кардани маҳсулоти афзояндаи ифлосшудаи dUTP аз системаи реаксия пеш аз реаксияи пурқувваткунии PCR истифода бурдан мумкин аст, пас барои пешгирӣ кардани натиҷаҳои бардурӯғи мусбат аз ифлосшавии маҳсулот.
2.Ҳарорати оптималии ферментҳои UNG, ки дар реаксияи зидди ифлосшавии PCR истифода мешавад, одатан 50 ℃ барои 2 дақиқа аст;ҳолати ғайрифаъолкунӣ 95 ℃ барои 5 дақиқа аст.
3.Аз яхобшавии зуд-зуд худдорӣ кунед ва ба тағирёбии бузурги ҳарорат дучор нашавед.
4.Генҳои мухталифе, ки бояд тақвият дода шаванд, дорои самаранокии истифодаи гуногуни dUTP ва ҳассосияти ферментҳои UNG мебошанд, аз ин рӯ, агар истифодаи системаи UNG боиси паст шудани ҳассосияти ошкор шавад, системаи реаксия бояд танзим ва оптимизатсия карда шавад, агар ба шумо дастгирии техникӣ лозим бошад, лутфан тамос гиред ширкати мо.
