Протеиназа K mNGS (моеъ)
Протеиназа К як протеазаи устувори серин бо хусусияти васеи субстрат мебошад.Он бисёр сафедаҳоро дар ҳолати модарӣ ҳатто дар ҳузури маводи шустушӯй вайрон мекунад.Далелҳо аз таҳқиқоти сохтори кристаллӣ ва молекулавӣ нишон медиҳанд, ки фермент ба оилаи субтилизин тааллуқ дорад, ки сегонаи фаъоли каталитикии макон дорад (Asp).39-Ӯ69-сер224).Ҷои бартаридоштаи тақсимшавӣ пайванди пептидӣ дар ҳамсоягии гурӯҳи карбоксилҳои аминокислотаҳои алифатикӣ ва хушбӯй бо аминокислотаҳои алфа-аминокӣ мебошад.Он одатан барои хусусияти васеи худ истифода мешавад.Ин протеиназа К махсус барои mNGS тарҳрезӣ шудааст.Дар муқоиса бо дигар протеиназа К, он дорои ифлосшавии кислотаи нуклеинӣ бо ҳамон як ферментативӣ мебошад, ки метавонад татбиқи поёноби mNGS-ро беҳтар таъмин кунад.
Шароити нигоҳдорӣ
2-8 ℃ барои 2 сол
Мушаххасот
| Намуди зоҳирӣ | Моеъи бе ранг то қаҳваранг |
| Фаъолият | ≥800 U/мл |
| Консентратсияи протеин | ≥20 мг/мл |
| Никас | Ҳеҷ кадоме ошкор нашудааст |
| ДНаз | Ҳеҷ кадоме ошкор нашудааст |
| RNase | Ҳеҷ кадоме ошкор нашудааст |
Хосиятҳо
| рақами EC | 3.4.21.64(Рекомбинант аз албоми Tritirachium) |
| Нуқтаи изоэлектрикӣ | 7.81 |
| рН оптималӣ | 7.0- 12.0 Расми 1 |
| Ҳарорати оптималӣ | 65 ℃ Расми 2 |
| устувории рН | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 соат) Расми 3 |
| Устувории гармидиҳӣ | Поёнтар аз 50 ℃ (рН 8,0, 30 дақ) Расми 4 |
| Устувории нигоҳдорӣ | Зиёда аз 90% фаъолият барои 12 моҳ дар 25 ℃ |
| Фаъолкунандаҳо | SDS, мочевина |
| Ингибиторҳо | фторофосфати диизопропил;фториди фенилметилсульфонил |
Барномаҳо
1. Маҷмӯаи ташхиси генетикӣ
2. Маҷмӯаҳои истихроҷи РНК ва ДНК
3. Истихроҷи ҷузъҳои ғайрипротеин аз бофтаҳо, таназзули ифлосҳои сафеда, аз қабили ДНКваксинахо ва тайёр кардани гепарин
4. Тайёр кардани ДНК-и хромосома тавассути электрофорези импулс
5. Блоти ғарбӣ
6. Реактивҳои альбуминҳои ферментативии гликозилшуда дар ташхиси vitro
Чораҳои эҳтиеткори
Ҳангоми истифода ё вазнкашӣ дастпӯшак ва айнаки муҳофизатӣ пӯшед ва пас аз истифода вентилятсияи хуб нигоҳ доред.Ин маҳсулот метавонад боиси аксуламалҳои аллергии пӯст ва хашми ҷиддии чашм гардад.Агар нафас кашад, он метавонад аллергия ё аломатҳои астма ё нафаскаширо ба вуҷуд орад.Метавонад боиси хашмгинии роҳҳои нафас гардад.
Таърифи воҳид
Як воҳид (U) ҳамчун миқдори ферменте муайян карда мешавад, ки барои гидролиз кардани казеин барои тавлиди 1 мкмоль лозим аст.тирозин дар як дакика дар шароити зерин.
Тайёр кардани реактивҳо
Реагенти I: 1 г казеини шир дар 50 мл маҳлули 0,1 М фосфати натрий (рН 8,0) гудохта, дар об дар ҳарорати 65-70 ℃ барои 15 дақиқа инкубатсия карда, омехта ва гудохт, бо об хунук карда, бо гидроксиди натрий ба рН 8 танзим карда, ҳаҷми собит карда шуд. 100 мл.
Реагенти II: 0,1М кислотаи trichloroacetic, 0,2M натрий ацетати, 0,3M кислотаи уксусӣ.
Реактив III: 0.4M Na2CO3ҳалли.
Реагенти IV: реактиви Форинт бо оби соф барои 5 маротиба маҳлул карда мешавад.
Реагенти V: Молкунандаи фермент: маҳлули фосфати натрий 0,1М (рН 8,0).
Реагенти VI: маҳлули тирозин: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин бо 0,2 гудохта шудааст.M HCl.
Тартиб
1. 0,5 мл реагенти I то 37 ℃ пешакӣ гарм карда мешавад, ба 0,5 мл маҳлули фермент илова кунед, хуб омехта кунед ва дар инкубатор кунед.37 ℃ барои 10 дақиқа.
2. Барои қатъ кардани реаксия 1 мл реагенти II илова кунед, хуб омехта кунед ва инкубатсияро барои 30 дақиқа идома диҳед.
3. Маҳлули реаксияи центрифугавӣ.
4. 0,5 мл супернатант гиред, 2,5 мл реагенти III, 0,5 мл реагенти IV илова кунед, хуб омехта кунед ва дар ҳарорати 37 ℃ инкубатсия кунед.барои 30 дақиқа.
5. ОД660ОД муайян карда шуд1;гурӯҳи назорати холӣ: 0,5 мл реагенти V барои иваз кардани фермент истифода мешавадҳалли барои муайян кардани OD660ҳамчун ОД2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. Каҷи стандарти L-тирозин: 0,5 мл консентратсияи гуногуни маҳлули L-тирозин, 2,5 мл реагенти III, 0,5 мл реагенти IV дар найчаи центрифугаи 5 мл, дар 37 ℃ барои 30 дақиқа инкубатсия кунед, барои OD муайян кунед660барои консентратсияи гуногуни L-тирозин, пас хатти стандартии Y=kX+b ба даст омад, ки дар он Y консентратсияи L-тирозин, X OD аст600.
Ҳисобкунӣ
2: Ҳаҷми умумии маҳлули реаксия (мл)
0,5: Ҳаҷми маҳлули фермент (мл)
0,5: Ҳаҷми моеъи реаксия, ки дар муайянкунии хромогенӣ истифода мешавад (мл)
10: Вақти реаксия (дақ)
Df: Равиши чандкарата
C: Консентратсияи фермент (мг/мл)
Иқтибосҳо
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Летт.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Рес.Коммун.(1971);44:513.
3. Ҳилз, Ҳ.ва дигарон,Ёвро.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Сэмбрук Ҷet ал., Клонкунии молекулавӣ: Дастури лабораторӣ, нашри 2, Харбор баҳори сардЛабораторияи матбуот, Харбор баҳори сард (1989).
Ракамхо
анҷир.1 Беҳтарин pH
Маҳлули буферии 100мМ: pH6.0-8.0, Na-фосфат;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH. Консентратсияи фермент: 1мг/мл
Расми 2 Ҳарорати оптималӣ
Реаксия дар буфери 20 mM K-фосфат pH 8.0.Консентратсияи фермент: 1 мг/мл
Расми 3 рН Субот
25 ℃, 16 h-табобат бо маҳлули буферии 50 мм: рН 4,5- 5,5, Ацетат;pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.рН 9,0- 12,5, Глицин-NaOH.Консентратсияи фермент: 1 мг/мл
Расми 4 Гармӣ субот
30 дақиқа-табобат бо буфери 50 mM Tris-HCl, pH 8.0.Консентратсияи фермент: 1 мг/мл
Расми 5 Нигоҳдорӣ устуворty at 25℃
